Putrescine finds wide industrial applications in the synthesis of polymers, pharmaceuticals, agrochemicals, and surfactants. Owing to economic and environmental concerns, the microbial production of putrescine has attracted a great deal of attention, and ornithine decarboxylase (ODC) is known to be a key enzyme in the biosynthetic pathway.
Herein, we present the design of ODC from Escherichia coli with high catalytic efficiency using a structure-based rational approach. Through a substrate docking into the model structure of the enzyme, we first selected residues that might lead to an increase in catalytic activity. Of the selected residues that are located in the α-helix and the loops constituting the substrate entry site, a mutational analysis of the single mutants identified two key residues, I163 and E165. A combination of two single mutations resulted in a 62.5-fold increase in the catalytic efficiency when compared with the wild-type enzyme. Molecular dynamics simulations of the best mutant revealed that the substrate entry site becomes more flexible through mutations, while stabilizing the formation of the dimeric interface of the enzyme. Our approach can be applied to the design of other decarboxylases with high catalytic efficiency for the production of various chemicals through bio-based processes.
Combining directed evolution with rational design has proven to be synergistic in optimization and enhancement of enzyme activity. Accuracy and efficiency of screening system is of great demand in directed evolution. In this aspect, genetic circuit system is suitable because it provides high accuracy and efficiency by reduced false positive through tight regulation and simple detection method. For this reason, we devised the genetic circuit system for ODC library screening. Analyzing putrescine-inducible genes, we designed vectors containing putrescine-inducible promoters fused with a reporter gene (EGFP). The constructs were transformed in putrescine-deficient strain ($W3110 \delta speC \delta speAB$), and were evaluated in various conditions. Three conditions showed good induction patterns of EGFP correlated with putrescine concentration gradients. We then evaluated EGFP induction patterns by ODC with various activities in the three conditions. The result was that the fluorescence intensity of EGFP was closely related to ODC catalytic activities. Therefore, our genetic circuit system is a useful tool for ODC library screening and can be applied to screening of other enzymes producing amine compounds.
Ultimately, the combination of rational design and directed evolution will be efficient for acquiring decarboxylases with high activity, which can be applicable in production of high valuable amine compounds.
퓨트레신은 폴리머, 의약품, 농약 및 계면활성제의 합성과 같은 다양한 범위의 산업적 응용이 가능한 물질이다. 하지만, 경제적 환경적 문제로 인해, 미생물을 통한 퓨트레신의 생산이 많은 관심을 받고 있고, 오르니틴 디카복실레이즈 (ODC) 는 생합성 경로에 중요한 효소로 알려져 있다.
여기에 우리는 구조 기반의 합리적 접근법을 이용하여 활성이 높은 대장균 ODC를 설계하였다. 효소의 모델 구조에 기질을 도킹시켜서, 우리는 첫 번째로 활성을 증가시킬 수 있는 몇 개의 잔기들을 선택했다. 그 잔기들은 기질이 들어가는 입구를 구성하는 $\alpha$ -헬릭스와 루프들에 위치하는 것들로, 단일 돌연변이를 도입하는 분석을 통해 그 중에서 두 개의 핵심 잔기인 I163과 E165를 찾아내었다. 이 단일 돌연변이의 조합을 통해 야생형에 비해 활성이 62.5배 증가한 돌연변이를 얻을 수 있었다. 가장 활성이 높은 돌연변이의 분자동역학 시뮬레이션은 돌연변이 도입은 기질이 들어가는 입구를 좀 더 유연하게 만들어 주었고, 효소 이합체의 인터페이스 형성은 안정화시키는 결과를 보여 주었다. 우리의 접근 방식은 바이오 기반 프로세스를 통한 다양한 종류의 화학물의 생산에 필요한 높은 활성을 가진 다른 디카복실레이즈들의 설계에 적용시킬 수 있다.
합리적 설계와 분자 진화 기술의 결합은 효소의 활성을 최적화 하거나 향상시키는데 있어서 시너지 효과가 있다는 보고들이 있다. 스크리닝 시스템의 정확성과 효율성은 분자 진화 기술에 있어서 필요한 요소이다. 이러한 관점에서 봤을 때, 유전적 회로 시스템은 매우 적합하다. 왜냐하면 그 시스템은 엄격한 조절에 의한 허위 양성 샘플의 수를 낮추고, 단순화시킨 검출 방법으로 정확성과 효율성을 제공하기 때문이다. 이러한 이유들 때문에, 우리는 ODC 라이브러리 스크리닝을 위한 유전적 회로 시스템을 고안하였다. 퓨트레신에 의해 발현이 유도되는 유전자들의 분석을 통해, 우리는 퓨트레신에 의해 유도되는 프로모터들과 리포터 유전자 (EGFP)를 결합시킨 유전자를 가지고 있는 벡터를 디자인 하였다. 그 벡터를 퓨트레신 합성 경로가 결손 된 균주에 넣어서 다양한 반응조건에서 평가하였다. 그 3가지 조건에서 넣어준 퓨트레신 농도에 따라 EGFP 패턴이 분리가 되는 것을 확인하였다. 그 3가지 선별된 조건을 바탕으로 여러가지 활성의 ODC에 의해 EGFP 발현 패턴을 평가하였다. 그 결과 EGFP의 형광 세기는 ODC의 활성과 밀접하게 관련 있다는 것을 확인하였다. 따라서 우리의 유전적 회로 시스템은 ODC 라이브러리 스크리닝에 있어서 유용한 도구이고, 아민 화합물을 생산하기 위해 필요한 효소의 스크리닝에 적용시킬 수 있을 것이다.
최종적으로 합리적 설계와 분자 진화 기술의 결합은 높은 활성을 가진 디카복실레이즈를 개발하는데 효과적이고, 이러한 시스템은 높은 고부가가치 아민 화합물을 생산하는데 응용할 수 있을 것이다.
