Peptide molecules that can specifically bind to targets with high affinity have diagnostic and therapeutic potential, and have emerged as alternatives to antibodies in market. However, the peptides with sufficient affinity and specificity for antigens of interest may not be present or readily isolated. Therefore, our group have developed peptide scaffold, termed ‘aptide’, that show high affinity and selectivity for specific target protein. In this thesis, I describe the application of this scaffold technology to the peptide inhibitor for cancer therapy. Further-more, I isolated human serum albumin specific aptide with potential for improving half-life of peptide drug.
In chapter 2. In this chapter, I described STAT3-targeting aptide for cancer therapy. STAT3 promotes the survival, proliferation, metastasis, immune escape and drug resistance of cancer cells, making its targeting an appealing prospect. However, while multiple inhibitors of STAT3 and its regulatory or effector pathway elements have been developed, bioactive agents have been somewhat elusive. Here, I described the identification of a specific STAT3-binding peptide ($APT_{STAT3}$) through phage display of a novel `aptide` library. $APT_{STAT3}$ bound STAT3 with high specificity and affinity (~231 nM). Addition of a cell-penetrating motif to the peptide to yield $APT_{STAT3}-9R$ enabled uptake by murine B16F1 melanoma cells. Treatment of various types of cancer cells with $APT_{STAT3}-9R$ blocked STAT3 phosphorylation and reduced expression of STAT targets, including cyclin D1, Bcl-xL, and survivin. As a result, $APT_{STAT3}-9R$ suppressed the viability and proliferation of cancer cells. Furthermore, intratumoral injection of $APT_{STAT3}-9R$ exerted potent antitumor activity in both xenograft and allograft tumor models. This results offer a preclinical proof of concept for $APT_{STAT3}$ as a tractable agent for translation to target the broad array of cancers harbouring constitutively activated STAT3.
In chapter 3. In this chapter, I described albumin-targeted aptide. Peptides are consid-ered as viable therapeutic agents because of their superior specificity compared to small mol-ecules and their smaller size relative to antibodies. However, the discovery of peptide drugs has been hampered by their short half-life and limited bioavailability. Many approaches have been explored to improve their pharmacokinetics including structural modifications and vari-ous delivery systems. Human serum albumin (HSA) is an endogenous molecule transporter with a half-life of 19 days, and thereby HSA has unique advantages over other plasma pro-teins as a drug carrier for improving the half-life of therapeutic peptides. However, coupling to HSA often reduces peptide bioactivity in the fusion form. To regain peptide activity, the coupled peptide should be liberated from its fusion form without modification. Here, I devel-oped HSA specific aptide for improving the half-life of therapeutic peptides. $APT_{HSA}$ specifi-cally bound to human serum albumin with high affinity and specificity. I made fusion proteins with peptide drug, exendin4 with short half-life, and $APT_{HSA}$. $Exendin4-APT_{HSA}$ showed long half-life more than exendin4 in the blood and showed potent anti-hyperglycemic activities in db/db mice for a long time compared to exendin4. Taken together, $APT_{HSA}$ is one of the new adaptor system showed the proof of concept for long circulation of peptide and protein drugs.
현재 질병 타겟에 높은 친화력을 가지며 특이적으로 붙는 펩타이드는 진단과 치료 분야에서 많은 이용가치를 가지고 있습니다. 이들의 장점은 생산 단가가 낮고 안전성 및 반응성이 높으며, 특허 로열티가 상대적으로 저렴하고, 원치 않는 독성이 덜하여 부작용이 낮으며, 합성을 통한 변형이 쉽고 정확합니다. 그러나 펩타이드는 특정 단백질에 대해 낮은 친화력 및 특이성을 보이기 때문에 후보 약물이 되거나 여러 응용분야에 사용되기 힘든 단점을 가지고 있습니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해서 앱타이드라는 신규 펩타이드 스캐폴드를 디자인하였고 특정 타겟에 대해서 고친화력, 고특이성을 가짐을 증명하였습니다. 학위과정 동안 수행한 연구는 이러한 앱타이드에 대한 장점을 극대화 시키고, 여러 분야로 응용 가능하다는 것을 증명하는 것이었습니다.
먼저 2장에서는 세포내 타겟을 억제할 수 있는 앱타이드를 개발하여 기존 항체나 항체대체단백질들이 수행할 수 없는 부분을 앱타이드가 가능하다는 것을 보여주며 앱타이드의 장점을 부각시키는 연구에 대한 내용입니다. 단백질은 세포막을 통과할 수 없기 때문에 세포내 분자를 타겟팅하는 것이 거의 불가능합니다. 하지만 펩타이드의 경우 세포투과펩타이드를 통해서 쉽게 세포막을 통과할 수 있게 되어 세포내 분자를 타겟팅이 가능하게 됩니다. 앱타이드는 다른 항체대체단백질과는 다르게 펩타이드 수준이기 때문에 세포투과펩타이드를 통해 손쉽게 세포막을 통과할 수 있습니다. 본 연구에서는 암 바이오마커인 STAT3에 특이적으로 결합하는 앱타이드를 발굴하였고, 이를 이용하여 항암효과를 보여주었습니다. STAT3에 특이적인 앱타이드는 친화력이 231nM 로 일반적인 펩타이드 수준 이상입니다. 세포 내로 전달하기 위해서 세포투과펩타이드인 9R 을 앱타이드의 C말단에 붙여주었으며, 이렇게 제작된 STAT3앱타이드-9R은 암세포의 성장에 있어서 매우 중요한 단백질인 STAT3 단백질의 활성화를 억제함으로써 암세포의 성장을 저해함을 보여주었습니다. 이를 통해 여러 암세포(A549, B16F1, MDAMB231, HepG2, U87MG)에서 암세포의 성장을 억제함을 보여주었으며, 나아가 암 동물모델에서도 그 효과를 보여주었습니다. 이렇게 개발된 STAT3 앱타이드-9R은 동물실험에서 항암효과를 보여준 최초의 STAT3 펩타이드 억제제로써 그 의미가 있습니다.
두번째로 3장의 내용은 반감기가 짧은 펩타이드 약물의 반감기를 향상시키기 위한 전략으로 알부민에 특이적으로 결합하는 앱타이드를 이용한 서방형제제 개발에 대한 연구입니다. 이 연구에서는 인간 알부민 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타이드를 파지 디스플레이를 통해 발굴하였으며, 반감기가 짧은 당뇨병 치료제인 exendin4 를 붙여주어 재조합단백질을 재작하였습니다. 이렇게 개발된 알부민 앱타이드-exendin4 재조합 단백질을 통해 실제 당뇨병 쥐 모델에서 혈당이 조절됨을 확인하였으며, 오리지널 약물인 exendin4 에 비해서 반감기가 4배 증가한 것을 약물동력학 연구를 통해 증명하였습니다. 이 연구를 통해서 앱타이드가 기존 항체처럼 다양한 분야로 적용가능 할 수 있으며, 특히 반감기를 향상 시킬 수 있는 어댑터 시스템 개발에 매우 효과적인 플랫폼 기술임을 증명하였습니다.
