Recombinant glycoprotein therapeutics has proven to be invaluable pharmaceuticals for the treatment of chronic and life-threatening diseases. Since 2001, Recombinant human BMP-7 (rhBMP-7) has used as an alternative to autograft in bone non unions such as the tibial non union and spinal fusions. Although these are extraordinarily efficacious, high dosage requirements of several hundred milligrams of protein for each ad- ministration, often makes the treatment expensive. The major challenge currently lies in the develoment of large-scale, cost-effective manufacturing processes for BMP-7 molecules.
BMP-7, a complex glycoprotein, is synthesized as a large precursor and requires proteolytic cleavage in the late secretory pathway for its maturation into functionally active form. Thus rhBMP-7 is routinely pro- duced in CHO cells, as they provide efficient platform for protein synthesis, post translational modification and secretion. Inspite of this, BMP-7 production in CHO cells yields low titers for a number of reasons.
In order to understand the bottleneck which limits the production of BMP-7 in CHO cells, a compre- hensive study of the BMP-7 producing CHO cells (CHO BMP-7) were undertaken. A suspension batch cul- ture of the CHO BMP-7 resulted in the production of $3-5 \mu g/ mL$ which is atleast 10 times lesser than the pro- tein of similar size produced in CHO cells. On analysis of the culture supernatants, it was found that a significant amount of unwanted precursor forms of rhBMP-7 (ca. 69% of total rhBMP-7), along with the mature form of rhBMP-7, was secreted into the culture medium, likely due to the insufficient amount of the proprotein convertases (PC) within the secretory pathway. Additionally, the secreted BMP-7 in the medium was unstable and underwent degradation when the viability dropped below 90%. As the first step to solve the precursor accumulation, the characterization of proprotein convertases in CHO BMP-7 was undertaken. Inves- tigation of the PC levels in CHO BMP-7 revealed the presence of higher levels of PC7 than furin, but defi- ciency in PACE4 and PC5/6. Additionally, Treatment with proprotein convertases inhibitors suggested the intracellular furin as the major PC responsible for BMP-7 maturation in CHO cells. Thus engineering the CHO BMP-7 cells for overexpressing these PCs would provide sufficient proteolytic cleavage thereby augmenting the mature BMP-7 forms during manufacturing processes.
Of the two PCs identified for contributing for BMP-7 maturation, furin is the ubiqitously expressed PC which is responsible for majorityof the processing events in constitutive secretory pathway. Also the soluble form of furin (PACEsol) was proven to be more potent than full length membrane bound form. Thus PACEsol overexpression in BMP-7 producing CHO cell line was attempted. Overexpression of PACEsol was effective in processing the precursor forms of BMP-7, while it did not significantly affect cell growth. As a result, the culture supernatants of CHO BMP-7 cells overexpressing PACEsol contained almost 100% of the mature BMP-7 form. Further the activity of the Taken together, the results show that PACEsol overexpression in CHO BMP-7 cells is an efficient means of increasing the production of mature BMP-7 and facilitating the downstream purification steps by eliminating the need to remove the precursor forms.
In vivo and in vitro studies reported the redundany of PCs towards their substrates as they share similar cleavage site but show distinct substrate specificity. Inorder to study the effect of other widely expresses PCs, PACE4, PC5/6 and PC7 on BMP-7 processing, a transient overexpression of their full length and soluble forms of PCs were performed. Transient over expression of PCs showed that PC5/6 and PACEsol were able to eliminate BMP-7 precursors in culture supernatant while PACE4 and PC7 were inactive. PC5/6, with processing efficiency of 1.3 times higher than PACEsol is the most efficient in BMP-7 processing. Stable overexpression of secreted form of PC5/6 ($PC5/6\delta C$) in CHO BMP-7 did no or positive impact on the growth parameters and productivity. BMP-7 precursor forms from culture supernatant of stable clones were completely eliminated and that the elimination was depended on the stoichiometric ratio of $PC5/6\delta C$ and BMP-7 productivity. N-terminal amino acid analysis revealed that both furin and PC5/6 shared same proteolytic cleavage site $RSIR_{293}↓$ on BMP-7 precursor resulting in identical mature forms. Further the in vitro biological activity of mature BMP-7 from $PC5/6\delta C$ and CHO BMP-7 were confirmed by alkaline phosphatase induction in ATDC5 cells.
In conclusion, both PACEsol and $PC5/6\delta C$ engineering can eliminates the proBMP-7 forms and en- hance the yields of mature forms in CHO cells. However when the productivity of the cells are augmented by gene amplification, or by optimization of culture process or conditions or by means, then the applicability of the high efficiency of $PC5/6\delta C$ can prove beneficial in precursor processing and facilitate downstream pro- cessing.
치료용 재조합 당단백질은 만성적이고 생명을 위협하는 질병들을 치료하기 위한 귀중한 의약품으로써 널리 알려져 있다. 2001 년부터 재조합 인간 골형성 단백질- 7(Bone Morphogenetic Protein-7)은 경골 불유합과 척추고정술과 같은 골절 불유합의 자가이식 대체물로써 사용되었다. 뛰어난 효율성에도 불구하고 몇 백 밀리그램이 요구되는 의약품의 높은 투여량 때문에 치료에 많은 비용이 든다. 그렇기 때문에, 현재 가장 주요한 쟁점은 비용 효과적인 BMP-7 단백질 생산을 위한 대용량 배양 공정을 개발하는 것이다.
복합 당 단백질인 BMP-7 은 크기가 큰 전구체로 합성이 된 후, 기능적으로 활성을 가진 형태로 성숙하기 위해 분비 경로 후반부에서 단백질 가수분해 절단이 요구된다. rhBMP-7 은 단백질 합성, 번역후변형, 분비 과정에 효율적인 플랫폼을 제공하는 CHO 세포에서 주로 생산된다. 그럼에도 불구하고, CHO 세포에서의 BMP-7 의 생산은 여러 이유로 인하여 낮은 생산성을 가진다.
CHO 세포에서 BMP-7 생산을 제한하는 bottleneck 을 이해하기 위해서, CHO 세포에서의 BMP-7 단백질 생산에 대하여 광범위한 연구를 수행하였다. BMP-7 을 생산하는 CHO 세포주의 부유 배양시 $3-5 \mu g/ mL$ 의 생산성을 보였지만, 이는 CHO 세포에서 생산되는 비슷한 크기의 치료용 단백질에 비해서 약 10 배 적은 값이다. 배양액을 분석한 결과, 완전한 형태의 rhBMP-7 단백질과 함께 제대로 프로세싱이 되지 않은 전구체 형태의 rhBMP-7 단백질이 전체 단백질 중에서 약 69% 정도 발현되는 것을 확인하였다. 이는 단백질의 분비과정 중에서 Proprotein Convertases (PC) 의 양이 부족하기 때문일 것으로 가정하였다. 게다가, 분비되어 배지에 존재하는 BMP-7 단백질은 불안정하여 세포의 viability 가 90% 밑으로 떨어지게 되면 단백질의 분해가 발생한다. 전구체 물질이 축적되는 문제를 해결하기 위해서 첫 단계로 CHO BMP-7 세포주에서 단백질 생산에 관여하는 protein convertases 들의 특성을 이해하고자 하였다. CHO BMP-7 세포주의 PC 의 양을 조사한 결과 PC7 의 양이 furin 보다 많았지만, PACE4 와 PC5/6 가 결핍된 것을 확인하였다. 또한, proprotein convertases 억제제를 첨가하는 실험을 통해서 세포 내 furin 이 CHO 세포의 BMP-7 maturation 을 일으키는 주요한 PC 임을 확인하였다. 그러므로, 이러한 PC 들을 과발현 시켜 CHO BMP-7 세포주를 엔지니어링 함으로써 충분한 단백질 가수분해 절단을 제공하고, 생산 과정 중에서 mature BMP-7 형태가 증가하는 것을 검증하였다.
BMP-7 성숙에 관여한다고 알려진 두 개의 PC 중 하나인 furin 은 편재하게 발현되며, 분비 과정에서 전반적인 프로세싱 과정에 관여한다. 또한 용해되는 형태의 furin 인 PACEsol 은 온전한 길이의 막 결합 형태보다 더 강력하다고 입증되었다. 따라서 본 연구에서는 CHO BMP-7 세포주에서의 PACEsol 과발현을 수행하였다. PACEsol 과발현은 BMP-7 의 전구체 프로세싱에 효과적이었으며, 세포 성장에 영향을 주지 않았다. 또한 PACEsol 과발현 CHO BMP-7 세포주의 배양액은 거의 100 %의 mature BMP-7 형태를 가지는 것을 확인하였다. 이 후 활성도 측정을 한 결과, CHO BMP-7 세포주에서 PACEsol 과발현은 mature BMP-7 생산을 증가시키고 전구체 형태를 제거할 필요가 없어 정제 과정을 용이하게 하는 효과적인 수단임을 검증하였다.
최근 In vivo 와 in vitro 연구에서 PC 들이 비슷한 절단 위치를 가지지만 뚜렷한 기질 특이성을 보이는 기질 중복성이 보고되었다. 다른 PC 들의 효과를 연구하기 위하여, PACE4 , PC5/6 , PC7 의 온전한 길이의 형태와 용해되는 형태를 일시적으로 과발현 시키는 연구를 수행하였다. PC 의 일시발현 실험을 통해 PACE4 와 PC7 은 BMP-7 프로세싱에 비활성을 보였지만, PC5/6 와 PACEsol 은 배양액의 BMP-7 전구체를 제거함을 확인하였다. PACEsol 에 비해 1.3 배 높은 효율을 보인 PC5/6 가 BMP-7 프로세싱에 가장 효과적임을 검증하였다. 또한 CHO BMP-7 세포주에서 PC5/6 의 분비 형태인 $PC5/6\delta C$ 을 과발현하여 세포 성장과 생산성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. $PC5/6\delta C$ 과발현시킨 클론들의 세포 배양액에서 BMP-7 전구체 형태는 관찰되지 않았으며, 전구체 제거는 $PC5/6\delta C$ 와 BMP-7 생산성의 stoichiometric(화학량적인) 비율에 의존함을 확인하였다. N-terminal 아미노산 분석을 통해 furin 과 PC5/6 둘 다 같은 단백질 가수분해 절단 위치인 $RSIR_{293}↓$ 를 가지며 동일한 BMP-7 mature 형태를 만드는 것임을 확인할 수 있었다. 또한 ATDC5 세포에서의 alkaline phosphatase induction 을 이용한 in vitro 활성도 실험을 통해 $PC5/6\delta C$ 과발현 세포주와 CHO BMP-7 세포주에서 생산된 mature BMP-7 이 생물학적 활성을 가짐을 확인하였다.
결론적으로, 본 연구를 통해 PACEsol 과 $PC5/6\delta C$ 엔지니어링이 proBMP-7 형태를 제거하며 CHO 세포주에서 mature BMP-7 의 양을 증가시킴을 검증하였다. 특히 세포의 생산성이 유전자 증폭 혹은 배양 공정 최적화에 의해서 증가될 때 높은 효율을 가진 $PC5/6\delta C$ 를 적용함으로써 전구체 프로세싱과 정제를 포함한 배양 후반 과정을 용이하게 함을 확인하였다.
