In neural communications, the formation of the soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor (SNARE) complex provides mechanical thrust for the synaptic membrane fusion to release neurotransmitters. Although the SNARE complex acts intrinsically as a molecular ‘transducer’ from the Brownian motion of a vesicle to the directional propulsion, but its practical mechanism in the mechanical perspective is still unclear owing to the experimental limitation. This thesis presents the mechanical responses of a single neuronal SNARE complex1 using magnetic-tweezers technique. The single SNARE complexes are observed as being unzipped with over 30 pN force. When rezipping is induced by lowering the force to ~10 pN, only a partially assembled state results, with the C-terminal half of the SNARE complex remaining disassembled. Reassembly of the C-terminal half occurs only when the force is further lowered below 10 pN. Thus, the mechanical hysteresis, characterized by the unzipping and rezipping cycle of a single SNARE complex, produces the partially assembled state. In this metastable state, unzipping toward the N-terminus is suppressed while zippering toward the C-terminus is initiated as a steep function of force. This ensures the directionality of SNARE complex formation, making the SNARE complex a robust force-generating machine.
Further, known as 20S complex, the interactions of SNARE complex with N-ethylmaleimide-sensitive factor (NSF) and one of soluble NSF attachment proteins (α-SNAP) were examined. In neurons, the SNARE complexes are disassembled by the coordinated action of NSF and α-SNAP and the disassembled SNARE proteins are recycled for saving the chemical energy. Hence, the disassembly stage of the SNARE complex has very high significance but its molecular mechanism is uncertain. From the observation of extension changes in SNARE complexes with sub-nm accuracy, it is supposed that the α-SNAP destabilize the linker domains of SNARE complex and then NSF disassemble it at a stroke within ~20 ms. Thus, this result supports the global unwinding model as the disassembly mechanism, not the opposite paradigm of the processive unwinding model. In this dissertation, in short, the mechanical properties of a SNARE complex and the disassembly mechanism by NSF/α-SNAP were studied with the magnetic tweezers at the single-molecule level.
본 논문에서는 SNARE 복합체의 역학적 특성과 NSF / α-SNAP 단백질에 의한 SNARE 복합체의 분해 기작을 단분자 자기집게를 이용하여 연구하였다. 또한 기존 자기집게 기술을 응용하여, 1) 실험 중 용액을 삽입할 있는 유체시스템과 2) 전반사 형광현미경, 3) 암시야 현미경이 결합된 자기집게를 개발하였다.
SNARE 복합체는 소포체에 ‘힘을 작용하여’ 세포막과의 막 융합을 매개하는 단백질로 알려져 있기 때문에 역학적 관점에서의 연구가 반드시 필요하다. 하지만 하나의 단백질 복합체에 적절한 힘을 가해야 하는 기술적 장벽으로 인해 지금까지 이러한 생물물리학적 연구에 어려움이 있었다. 본 연구에서는 SNARE 복합체 한 개 분자에 적절한 힘을 가할 수 있는 자기집게 기술을 개발함으로써 SNARE 복합체의 분자 기작을 밝혀내었다. SNARE 복합체에는 ~25 pN 이상의 ‘역학적 이력특성’이 있다는 것이 관측되었으며, 이러한 이력 특성은 복합체가 한 방향으로 형성하면서 힘을 작용한다는 학계 정론의 역학적 원리로 제안된다. 또한 이러한 이력 특성으로 인해 구조적인 중간상태를 발견할 수 있었는데, 이 상태는 신경전달을 위해 신경전달물질이 ‘동시에’ 방출되도록 하는 핵심구조일 것으로 생각된다.
또한 SNARE 복합체가 막 융합을 유도한 다음에는, NSF / α-SNAP 단백질에 의해 개개의 SNARE 단백질들로 분해되어 재활용된다고 알려져 있다. 이러한 사실에 착안하여, 나노미터 이하의 정확도로 (20S 복합체로 불리는) 단백질들간의 상호작용을 측정함으로써 NSF / α-SNAP 단백질에 의한 SNARE 복합체의 분해 기작을 연구하였다. 본 논문의 연구결과에 의하면 SNARE 복합체는 먼저 α-SNAP 단백질에 의해 linker 영역이 불안정하게 되고 이렇게 불안정한 SNARE 복합체는 NSF 단백질에 의해 ~20 ms 이하의 속도로 ‘단번에’ 분해되는 것을 측정할 수 있었다. 이러한 측정결과는 NSF 단백질이 SNARE 복합체를 ‘점진적으로’ 분해한다는 가설에는 반대되며, SNARE 복합체 분해에서 α-SNAP 단백질과 NSF 단백질 각각의 역할을 밝혀냈다는 사실에 의의가 있다.
마지막으로 본 논문에서는 SNARE 복합체와 20S 복합체의 분자기작을 연구하기 위해, 하나의 단백질 복합체에 수~수십 pN 의 힘을 가할 수 있으며 이에 따른 분자의 길이 변화를 나노미터 수준의 분해능과 옹스트롬 수준의 정확도로 측정할 수 있는 자기집게를 개발하였다. 본 논문에서 개발한 자기집게는 전반사 형광현미경과 결합되어 있어 FRET 변화를 동시에 측정할 수 있으며, 암시야 현미경으로 전환 가능하도록 설계되었다. 본 연구에서 개발된 자기집게는 특정 생체분자의 역학적 기작이나 생체분자들 사이의 상호작용을 연구하기에 매우 유용한 기술이 될 것으로 기대된다.
