Tissue adhesive biomaterials are attractive sources of medical devices for the wound dressing, sur-gical tissue adhesives, wrinkle fillers and hemostasis in surgical procedures as well as local drug depots and tissue engineered scaffolds. However, it has been difficult to synthesize the tissue adhesive biomaterials to be attached robustly on target tissues mainly due to the presence of water in human body and large amount of water content of crosslinked hydrogels. In nature, the countless marine creatures such as mussels, sandcastle worms, and sea cucumbers have strong adhesiveness to various organic/inorganic materials. Especially, adhe-sion behavior of the marine mussels is one of the well-known studies that can be opportunity to develop the biocompatible, adhesive medical devices. Blue marine mussel (Mytilus edulis) secretes adhesive proteins, called Mytilus edulis foot protein (Mefp), which have an unusual amino acid, L-3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (DOPA). The major driving forces of mussel adhesion are related to catechol (ortho-dihydroxyphenyl) groups of DOPA showing the superior adhesiveness to various materials including rocks, ships, Teflon (Polytetrafluoroethylene) and even biomacromolecules. Importantly, mussel adhesive proteins contain the positively charged residues (e.g., Lys, His) that show the lack of negatively charged residues. It is noted that amine groups are co-contributed with the catechol groups to mussel adhesion via covalent/non-covalent reactions such as Michael-type addition reactions, Schiff-base formations, and π-cation bonds. Thus, catechol and amine groups are significant elements to enhance the under-water adhesion. In other word, polymers with catecholamine moieties might be superior to the ones with just catechol-tethered polymers in adhesion and other biological effects.
Inspired by mussel adhesion behaviors, we synthesized a multiple catechol groups-conjugated chi-tosan (CHI-C) to fabricate the biocompatible, adhesive medical devices. The synthesis protocol was well-organized to prevent the spontaneous oxidation of catechol groups and for scale-up supplying for the commercial, medical products. The catechol groups in chitosan backbone served as inter-molecular crosslinker and adhesive moieties. In thesis dissertation, we introduce the biomedical applications using adhesive CHI-C in hemostatic hydrogels, self-crosslinked polymeric thin films, and multi-purpose patches for water-rich peritoneal environments. In addition, a novel crosslinking method that we have developed for the biocompatible, in situ gelling, adhesive, catechol-conjugated polymer hydrogels is also demonstrated.
The first part (Charpter 2) of my thesis is development of adhesive, temperature-sensitive CHI-C based hydrogels for the hemostasis in surgical procedures. CHI-C was crosslinked with terminally thiolated Pluronic F-127 triblock copolymer (Plu-SH) to produce temperature-sensitive and adhesive sol-gel transition hydrogels. A blend mixture of the CHI-C and the Plu-SH was a viscous solution state at room temperature but became a crosslinked gel state with instantaneous solidification at the body temperature and physiological pH. We found that the conjugation of catechol moieties, the key components of mussel adhesion, is highly beneficial for (1) chemical crosslinking of chitosan and Pluronic, and (2) rapid and strong adhesion of the hydrogels on soft tissues and mucous layers. The adhesive chitosan/Pluronic injectable hydrogels with remnant catechol groups showed strong adhesiveness to soft tissues and mucous layers and also demonstrated superior hemostatic properties. These chitosan/Pluronic hydrogels are expected to be usefully exploited for injectable drug delivery depots, tissue engineering hydrogels, tissue adhesives, and antibleeding materials.
The second part (Chapter 3 and 4) is development of biocompatible catalyst for the adhesive phe-nolic compound derivative hydrogels including CHI-C hydrogels. Phenol derivative-containing adhesive hy-drogels has been widely recognized as having potential for biomedical applications, but their conventional production methods of utilizing a moderate/strong base, alkaline buffers, the addition of oxidizing agents or the use of enzymes require alternative approaches to improve their biocompatibility. Thus, we report a poly-meric, enzyme-mimetic biocatalyst, hematin-grafted chitosan (chitosan-g-hem) which results in effective gelation without the use of alkaline buffers or enzymes. Furthermore, gelation occurs under mild physiologi-cal conditions. Chitosan-g-hem biocatalyst (0.01%, w/v) has excellent catalytic properties, forming CHI-C hydrogels rapidly (within 5 min). In vivo adhesive force measurement demonstrated that the hydrogel formed by the chitosan-g-hem activity showed an increase in adhesion force (33.6 ± 5.9 kPa) compared with the same hydrogel formed by pH-induced catechol oxidation (20.6 ± 5.5 kPa) in mouse subcutaneous tissue.
One of the most challenging problems is the unavoidable incorporation of non-biological catalysts. Examples include the incorporation of Cu (I), periodate, FeCl3, or enzymes within three-dimensional polymer-ic networks of hydrogels. Catalysts encapsulation or incorporation has been a significant problem in Food and Drug Administration (FDA) permissions for human trials. Here, we introduce an entirely new method for forming hydrogels, wherein the formation is triggered by a catalyst, but the resulting hydrogels are catalyst-free. We unexpectedly found that sufficient amount of crosslinkable catecholquinone/semiquinone free radi-cals is generated by physical contact between catechol-containing polymers and surface-immobilized cata-lysts. A contact time of 1 min between the polymer solution and the immobilized catalysts results in the solu-tion becoming a hydrogel within 30 min after injection. This approach is notably different from previously studied catalyst-mediated hydrogels in that the method described herein generates chemically active interme-diates which kinetically react with the polymer molecules being hydrogels at a later time point in the absence of the catalyst molecules. This mechanism allows the fabrication of catalyst-free hydrogels. Thus, this new chemical method for preparing hydrogels can provide an effective way of reducing potential toxicity for a variety of medical settings and ultimately for human trials and regular use.
The third part (Chapter 5) is development of biocompatible CHI-C films without using any additives and high temperature process. We demonstrate spontaneous formation of water-insoluble, biocompatible microfilms from a water-soluble polymer without using any chemical additives similar to the biological process in the insect cuticle formation. We found that water-soluble CHI-C polymeric precursor is spontaneously converted to flexible thin film by simple dehydration process. Considering most water-soluble polymers form powders instead of films when dehydrated, prepared robust, water-insoluble, flexible chitosan film is the completely unexpected result. The film can be used as a bag similar to polyvinyl one and be multifunctional and biocompatible for drug delivery depots and tissue engineering applications.
Finally, we have developed bio-adhesive patch as a therapeutic agent in water-rich intraperitoneal environments (Chapter 6). Intraperitoneal (IP) patch was prepared by a simple freeze-drying method using CHI-C. This IP patch showed the excellent mechanical property and superior adhesiveness on tissue surfaces. We have also prepared three mouse models to properly evaluate the performance of IP patch in water-rich environments: intestine anastomosis rat model, colon cancer mouse model, and hemorrhaging rat liver model. IP patch is effective in the intestine anastomosis by biocompatible sealing of the incision sites, inhibits cancer growth by releasing 5-fluorouracil from the stably anchored patch, and arrests the urgent bleeding by robustly forming physical barriers on hemorrhaging sites. Thus, the multi-purpose IP patch can be usefully exploited as adhesive biomaterials in intraperitoneal environments.
인체의 약 60-80%는 물로 구성되어 있어, 효율적인 약물전달이나 조직공학을 위해서는 생체친화적이고 생분해성을 가지는 습식접착 의료기기가 필요하다. 현재 조직접착제로 사용되고 있는 시아노아크릴레이트 (cyanoacrylate) 계열의 접착제는 조직과의 접착력은 우수하나, 사용되는 용매가 유독하고 체내에서 분해시 포름알데히드 (formaldehyde)가 형성되어 의료용으로 사용하기에는 적합하지 않다. 또한, 지혈이나 장문합 보조제, 창상 치유제로 많이 사용되는 피브린 글루 (fibrin glue)는 접착력이 약하고, 바이러스 (virus)나 프리온 (prion)에 의한 오염 (contamination)과 같은 문제가 있다. 그러므로 생체친화적이고 생분해성이면서 수분의 존재 하에서 빠르게 접착하여 기계적 물성을 유지할 수 있는 접착성 의료기기의 개발이 필요하다.
이에 본 연구에서는 홍합의 접착원리에 기인하여, 물 속에서도 안정하게 접착할 수 있는 의료기기를 개발하였다. 바다홍합 (mussel)은 바위나 산호초와 같은 다양한 유무기 물질에 붙어서 자라는 데, 이는 카테콜 (catechol)기에 의하여 접착한다고 보고되어 있다. 이에 따라 생체 친화적 양이온성 고분자인 키토산 (chitosan)에 홍합의 접착물질인 카테콜을 도입하여 의료기기 개발을 위한 나노소재를 제조하였다. 그리고 카테콜기의 산화를 방지하고 산업적 의료제품 생산을 위하여 카테콜기가 도입된 키토산 (키토산-카테콜) 합성 방법을 최적하였다. 이를 통해 키토산-카테콜을 이용하여 지혈접착 하이드로젤을 제조하였으며, 자가조립을 통해 형성되는 마이크로필름, 그리고 수분이 많은 복강내 환경을 위한 다목적 패치를 제조하였다. 또한 생체친화적이고 빠른 시간 내에 접착성하이드로젤을 형성시키기 위하여 새로운 촉매를 개발하였다.
첫 번째로, 수술 도중 발생할 수 있는 출혈을 지혈하기 위해 온도 감응성을 가지고 접착력이 있는 키토산-카테콜/플루로닉 (Pluronic) 조성의 하이드로젤을 개발하였다. 키토산-카테콜은 양말단에 싸이올 기가 도입된 플루로닉과 결합하여 졸-젤 상전이 특성을 보이며, 상온에서는 점도가 있는 용액이지만 체내 온도가 되면 급격하게 고체화되어 가교된 젤을 형성하였다. 이러한 용시젤화 특성을 보이는 하이드로젤은 반응하지 않은 카테콜로 인하여 연조직이나 점막과 같은 부드러운 조직에 강한 접착력을 가지는 것을 확인하였다. 또한 쥐의 간 지혈 모델을 통해 지혈 특성을 확인해 본 결과, 지혈능력이 있는 키토산 분자의 특성과 하이드로젤의 강한 기계적 특성으로부터 형성된 피와의 격막 형성으로 인하여 우수한 지혈능력이 있음을 확인하였다. 홍합의 접착원리에 기인한 키토산-카테콜/플루로닉 하이드로젤은 광범위한 응용이 가능하며, 특히 의료용 소재로써 약물전달 및 조직공학에 있어 널리 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
두 번째로, 키토산-카테콜의 접착성 하이드로젤의 제조를 위하여 생체친화적인 촉매를 개발하였다. 카테콜기를 도입한 고분자를 생체 친화적 접착체로 이용하기 위해서는 조직과의 접착뿐 아니라 내부적인 응집력을 향상시키는 것 역시 중요한 문제이다. 이를 위해 철을 함유하는 포피린 구조를 가진 과산화효소 (horseradish peroxidase, HRP)를 모사하여, 키토산 고분자에 헤마틴 그룹을 도입한 생체 친화적 촉매를 개발하였다. 본 생체 친화적 촉매는 기존 헤마틴에 비해 생물학적 환경에서 매우 좋은 용해도를 나타내었으며, 상대적으로 높은 농도에서도 300-400 nm의 입자형태를 가져 높은 분산력을 보였다. 또한 개발된 촉매는 카테콜 그룹이 도입된 고분자를 화학적으로 결합시켜 고분자 내의 응집력을 향상시킬 수 있고, 접착력 역시 증가시키는 것으로 나타났다. 본 HRP를 모사한 생체 친화적 촉매는 의료분야뿐 아니라 여러 산업에 있어 광범위한 응용이 가능하며, 특히 의료용 소재로써 약물전달, 조직 공학, 또는 임플란트 식립을 위한 접착성 하이드로젤을 제조하는 데 있어 널리 응용이 가능하다.
세 번째로는, 표면에 촉매를 고정화시켜 키토산-카테콜 접착성물질의 활성을 유도하여 빠른 시간내에 하이드로젤이 형성되면서도 최종 결과물에는 촉매가 없는 안전한 하이드로젤 제조시스템을 확립하였다. 이는 라디칼 반응을 매개할 수 있는 헤마틴을 표면에 고정화시킴으로 카테콜의 산화를 통하여 고분자화 (polymerization)되는 것이다. 이에 헤마틴을 주사기 내부에 고정화 시켜 키토산-카테콜 용액을 물리적으로 1분간 섞어 주고 주입하였을 때, 초기 용액은 고점도의 특성이 보이나 30분 이내에 하이드로젤이 형성되는 것을 확인하였다. 이는 예상하지 못한 독성이 있을 수 있는 생체촉매가 포함된 기존의 연구에서 탈피하여 촉매에 의하여 하이드로젤이 형성되지만 최종 결과물에는 촉매가 없으므로 다양한 의료소재 개발에 있어 응용가능성이 무궁무진하다.
네 번째로는 자가조립에 의하여 형성되는 키토산-카테콜 마이크로 필름을 제조하여 이를 약물전달용 담체 및 세포배양 필름으로 응용하였다. 키토산-카테콜은 기존의 키토산과는 달리 중성 용액에도 잘 녹는 특성을 보이지만 이를 공기중에서 건조하여 필름을 제조하면 물에 녹지 않고 강한 기계적 특성을 갖는 필름이 형성된다. 이는 카테콜기가 공기 중에서 산화되면, 카테콜이 반응성이 좋은 퀴논형태로 변화하게 되어 마이클-첨가반응 (Michael-type addition reactions)이나 시프 염기 형성 반응 (Schiff-base formation)에 의해 카테콜-카테콜, 카테콜-아민 결합이 형성되는 것으로 사료된다. 그리고 산화도를 조절하여 기계적 특성 및 광학적 특성이 다른 필름을 제조하였다. 또한, 제조된 필름에 약물을 담지하여 이의 방출 거동을 확인하였으며, 세포를 배양하여 세포이식용 필름으로써의 특성을 확인하였다.
마지막으로, 복강과 같은 물이 많은 환경에서 접착할 수 있는 키토산-카테콜 패치를 제조하였다. 키토산-카테콜을 물에 녹인 후 동결 건조를 하면 접착력 있는 스폰지를 제조할 수 있는데, 필름과 마찬가지로 산화도를 조절하여 기계적 특성을 조절하였다. 키토산-카테콜 패치를 의료기기로 활용하기 위해 3가지의 동물 모델을 만들었는데, 첫 번째는 장문합 모델로 대장에 용종이 생겼을 때, 용종 제거 후 장을 문합한 뒤 발생할 수 있는 배설물의 유출을 막기 위해 문합 후 키토산-카테콜 패치를 붙여 주어 보조제로 사용하는 것이다. 두 번째로는 암 절제 수술 후에 발생할 수 있는 암의 재발을 방지하기 위한 동물 모델로 대장암 세포를 복막에 주입한 뒤, 2주 뒤에 항암제가 담지된 키토산-카테콜 패치를 붙여 주어 항암효과를 확인하였다. 세 번째로는 쥐 간 지혈모델로, 복부를 개복한 뒤 18 G 주사바늘을 이용하여 상처를 내고, 키토산-카테콜 패치를 붙여 주어 지혈이 되는 것을 확인하였다. 결과적으로 키토산-카테콜 패치는 장문합 보조제로 우수한 특성을 보였으며, 우수한 지혈효과를 보였고, 항암제가 담지된 키토산-카테콜 패치는 암의 성장과 생존률을 2주 이상 지연시키는 것을 확인하였다.
결론적으로 본 연구에서 개발한 키토산-카테콜 기반의 의료기기는 생체친화성, 생분해성이면서도 수분의 존재 하에서 빠르게 접착할 수 있고, 기계적 물성을 유지하기 때문에 수술용 조직접착제나 지혈제, 약물전달용 담체, 조직공학용 담체, 주름 개선용 충진제 등 다양한 의료기기로 활용할 수 있다.
