A gene cloned from Pseudomonas sp., called HSM0414 directed the production of lipolytic activity. From the sequencing data, an open reading frame encoding a protein of 636 amino acids with an estimated molecular mass of 68.9 kDa was found. The product of the gene, named PalA, was processed by removal of an N-terminal signal peptide to yield a 66.4 kDa mature protein. The deduced amino acid sequence of PalA did not contain the typical GXSXG motif found in most esterases and lipases, suggesting that the protein is a member of a novel GDSL family of lipolytic enzymes. The predicted 636 amino acids in the protein encoded by palA showed 66% and 58% identity with P. aeruginosa PAO1 EstA and putative ORF of P. putida trpE-TrpG region, respectively. Amino acid sequence alignments led to the prediction that this lipolytic enzyme was an autotransporter protein that possessed a C-terminal β-barrel domain, allowing the secretion of the N-terminal catalytic domain harbouring the lipolytic activity. PalA is composed of two parts, the N-terminal region (Ala1-Ala296) similar to the GDSL lipases and C-terminal region (Leu320-Phe612) to the autotransporter.
The expression of PalA in E. coli, subsequent cell fractionation, whole-cell ELISA, external protease treatment, and in vitro refolding study revealed that the enzyme was associated with the cellular outer membranes. Autotransporter mode of surface presentation in Gram-negative bacteria requires a hypothetical C-terminal β-barrel which makes up an aqueous channel in the outer membrane. In this report, we provide biochemical and structural evidence demonstrating that the pore size of the β-barrel conduit is important to deliver the N-domain to cell surface. Among the all autotransporter domains, two strictly conserved residues $(Pro^{478} and Gly^{576} in PalA)$ are converted to other various residues using site-directed mutagenesis. This investigation was made into the different pore-size mutants, affecting the active folding of N-terminal moiety. Wild β-domain contains a cavity of ～2 nm diameter that is optimal for the export of the N-domains. However, deviation from the native size of the pore, whether it is larger or smaller, is not suitable for correct translocation of N-terminal passenger domain.
슈도모나스균의 유전자검색을 통해 지질가수분해 활성을 갖는 특이한 palA 유전자를 클로닝하였다. 이 유전자는 636개의 아미노산을 암호화하고 있으며 24개의 신호서열이 존재하고 추정된 아미노산 서열을 분석한 결과 일반적인 지질가수분해 효소가 갖는 전형적인 GXSXG 활성부위가 발견되지 않았다. 대신 이 단백질은 특이한 활성부위 서열을 갖는 GDSL계 지질가수분해 효소이다. 다른 단백질들과의 아미노산 서열의 유사성을 관찰한 결과, PalA는 C 말단에 β 배럴 도메인을 갖는 자가 수송 단백질들과 유사성을 보인다. 결국 PalA는 크게 두 부분으로 구성되어있는데 N 말단 부위 $(Ala^1-Ala^{296})$ 는 GDSL계 지질가수분해 효소를 구성하며 C 말단 $(Leu^{320}-Phe^{612})$ 은 박테리아의 외막에 구멍을 형성할 수 있는 β 배럴 구조를 갖는 자가 수송 도메인으로 구성되어 있다. 이종 균주인 대장균에서 PalA 단백질을 발현하여 세포분획, ELISA, 외부 단백질가수분해 효소의 처리, 퓨전 단백질의 발현 및 시험관 재접합 실험 등을 통해 이 단백질이 외막과 연관되어 있는 자가수송 단백질임을 밝혔다. 지금까지 밝혀진 모든 자가 수송단백질은 C 말단 도메인에 proline과 glycine이라는 두 아미노산이 일정하게 유지되고 있다. PalA에서는 proline 478번과 glycine 576번이 해당되며 이 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 다양한 돌연변이체를 만들어냈다. 이들 각각의 돌연변이 단백질은 서로 다른 지질가수분해 활성을 갖고 있으며 또한 리포좀 팽창 분석법으로 각각의 구멍의 크기를 측정한 결과 다양한 크기의 구멍을 형성하고 있음을 관찰하였다. 야생형의 β 도메인은 직경 ～2 nm의 구멍을 형성하나 다른 돌연변이체들은 이보다 크거나 작은 구멍 크기를 보였다. 그러나 야생형의 구멍 크기에서 벗어난 다른 돌연변이 단백질들은 모두 크기에 상관없이 지질가수분해 활성이 감소하였다. 이는 단백질의 구멍을 통한 수송에는 영향을 미치지 않으나 지질가수분해 활성을 갖는 N 말단 도메인의 적절한 접힘에 영향을 주는 것으로 보여지며 따라서 C 말단의 외막에 구멍을 형성하는 도메인은 적절한 단백질 접힘 환경을 제공함으로서 ‘폴데아제’의 기능을 수행한다.
