The Csm complex is a crRNA-guided effector complex that cleaves invader DNA in the prokaryotic immune response mediated by the type III-A CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas system. To understand function and mechanism of the crRNA-guided effector complex, I thoroughly examined CRISPR locus of hyperthermophilic archeon Thermococcus onnurineus and found the putative seven genes encoding Cas6, Csm1 (Cas10), Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, and Csx1 in a row. They are expected to assemble Csm complex that involve in pre crRNA processing, crRNA maturation, and target DNA interference. Based on structural and biochemical studies, I determined the structure of Cas10 from T. onnurineus (Ton_Cas10) and demonstrated that Ton_Cas10 possesses metal-dependent (Mg, Mn) nuclease activity against single-strnaded (ss-)DNA, double-stranded (ds-)DNA and (ss-)RNA, proposing Cas10 to be the catalytic subunit of the complex. Structure revealed the overall dimeric arrangement of Cas10 with four domains in each monomer including the putative DNA Hydrolase Domain (HD). The detailed structure of HD domain showed motif II to V, which were highly conserved in classical HD domain. However, instead of motif I in other subfamily, Cas10 HD has H201 residue on helix 8, suggesting the two-metal nuclease system. The two similar ferrodoxin-like domains, D1 and D2, were analyzed and novel β-sheet appendix architecture was extended after Zn finger motif in D1 domain. It also shares structural homology with antiparallel β-strand structure similar to RRM (RNA Recognition Motif) fold. On D2 domain, conserved GGDDF motif structure was found and it suggests the ATPase activity function. According to structural analysis, I carried out the ATPase activity assay and found that Cas10 showed the ss- DNA stimulated ATPase activity with a possible helicase function. Based on these results, I conclude that Cas10 is the catalytic subunit of Csm complex in type III-A CRISPR system. Csm complex with Cas10 would function standalone for interference nuclease activity without recruitment of other nuclease such as Cas3 that was found in type I.
CRISPR/Cas 은 원핵 생물 내에서 외부 유전물질을 가수분해 시키는 시스템이며 이중 제3-A형에 속하는 Csm 복합체는 최종 단계에서 RNA를 수식하고 타겟 외부 유전자를 분해하는데 관여하는 복합체이다. Csm 복합체의 기능과 활성 기작을 이해하기 위해, 초내열성 고세균인 T.onnurineus 의 CRISPR 유전자를 조사하여 일곱 개의 Cas 유전자가 Cas6, Cas10(csm1), Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csx1 의 순서로 나란히 배열되어 있는 것을 발견하였다. 이들은 Csm 복합체를 이루어, crRNA프로세싱, crRNA 성숙, 그리고 타깃 DNA의 간섭에 의한 분해 과정에 관여할 것으로 예상되고 이중 Cas10 (Csm1)은 복합체의 가장 큰 단위체로 분해 과정의 핵심기능을 할 것으로 추측된다. 본 연구에서는 X-ray 결정화를 이용한 T.onnurineus에 존재하는 Cas10의 구조를 규명 하였고 생화학적 연구를 통해 single or double DNA와 RNA에 대한 마그네슘, 망간 의존성 핵산 분해능이 있음을 확인하였으며, 이를 바탕으로 Cas10이 Csm복합체에서 활성소단위임을 제안하였다. Cas10의 구조는 DNA를 가수분해 할 수 있다고 알려진 HD 도메인을 포함한, 총 네 개의 도메인 (HD, D1, D2, C 도메인)으로 이루어져 있다. HD도메인에는 기존의 HD 도메인 군에 보존되어 있는 II~V 모티브와, 기존 모티브 I을 대체할 수 있는 8번 나선구조에 있는 201번 히스티딘 잔기로 이루어진 새로운 모티브 (I’)가 존재함을 알았고, 금속이온 두 개를 이용하는 핵산분해 효소들과 유사한 기작을 지닐 것으로 생각 되어진다. D1과 D2 도메인은 Ferrodoxin 유사 도메인으로 D1의 Zn finger 모티브 이후에는 RNA 인식 모티브와 유사성을 지닌 새로운 베타 병풍 구조가 있음을 밝혔다. D2에는 GGDDF로 구성된 모티브에 의해 ATP 분해 활성을 나타내었고 helicase 기능과 연관 되어 있음이 보여졌다. 결론적으로, 본 연구를 통해 Cas10은 제3-A형 CRISPR 시스템인 Csm 복합체의 활성 단위체에 합당한 구조와 기능이 있음을 보여주었으며 따라서 제3-A형 Csm 복합체는 핵산분해활성을 위해 추가적인 Cas3 효소가 필요한 제 1형 복합체의 경우와는 달리, 단독으로 핵산 분해 활성을 나타낼 수 있다고 추론된다.
