DNA microarrays are fabricated by robotic machines that arrange DNA spots in micro-scale onto the solid substrate. Each DNA spot contains very low amount of DNA probes which are covalently attached to the solid surface with several distinct chemistries. Since DNA probes are spotted at hundreds or thousands of sites from 10 to 500 microns size, it is possible to detect and measure thousands of genetic information simultaneously. Therefore, DNA microarray analysis has become the most widely used technology for the high-throughput analysis of nucleic acids including gene expression profiling, comparative genomic hybridization, single nucleotide polymorphism detection, and pathogen detection. Target nucleic acids to be analyzed are amplified by PCR amplification and hybridize to the specific capture probes by forming hydrogen bonds between complementary nucleic acids pairs. Particularly, when various genomic regions are analyzed simultaneously, multiplex PCR method is generally used to amplify several target nucleic acids in a single tube by using many primer pairs. However, an increase in the number of genetic regions for simultaneous amplification by multiplex PCR leads to the generation of non-specific amplification products due to the cross-reaction among primers. For the purpose of overcoming this problem, we have developed a novel PCR technology for the amplification of multiple genomic regions simultaneously which can be analyzed by DNA microarrays.
In the first strategy described in chapter 2, we have developed a novel multiplexed single-nucleotide polymorphisms (SNPs) genotyping method based on amplification of separated ligation-dependent probe (ASLP). In the ASLP technique, allele-specific ligation reaction was first performed between annealed allele-specific oligonucleotide (ASO) probe and locus-specific oligonucleotide (LSO) probe containing the unique regions of homology to target genomic DNA. The ASO probe covering up to SNP site is modified with universal forward primer site at the 5’ end while the LSO probe is extended with universal separation (US) site and poly A tail at the 3’ end. The two probes would be ligated when they are hybridized to a correctly matching sequence at a specific SNP locus. The separation probe that consists of universal reverse primer sequence labeled with biotin at the 5’ end and complimentary sequence of US at the 3’ end was then applied to the resulting ligated product. During the following extension reaction of the separation probe, the ligated probes were dissociated from target genomic DNA as a form of double-stranded DNA (dsDNA) with the strand extended from the separation probe. By using streptavidin-coated magnetic beads, the dsDNA containing ligated probes could be simply separated from the reaction mixture including genomic DNA and unligated probes. PCR amplification of the purified ligation products was then carried out using a primer pair of Cy3-labeled universal forward primer and universal reverse primer, followed by hybridization of the PCR products on DNA microarrays. Using this strategy we successfully genotyped fifteen SNP markers for the cultivar identification of pepper.
Furthermore, a modified version of ASLP technology and RecA-assisted hybridization (RAH) technology for multiplexed SNP genotyping is introduced in chapter 3. In the modified ASLP method, two allele-specific oligonucleotides (ASO), wild type allele-specific oligonucleotides (ASOW) and mutant type allele-specific oligonucleotides (ASOM), are specific to each allele of the SNP locus covering mutation point at the 3’ end and also include different universal forward primer (UF1 and UF2) sequences at its 5’ end. PCR amplification of the purified ligation products was then carried out by using universal primers (Cy3-labeled UF1, Cy5-labeled UF2 and UR). A highly efficient hybridization method of dsDNA on microarrays, which utilizes RecA protein as the mediator, has been also developed and characterized to enhance the sensitivity of ASLP technology. RecA, one of the single-stranded DNA binding proteins, binds to the capture probe to form DNA-protein filament. The resulting filament searches for the homologous region in the target dsDNA and catalyzes the strand exchange reaction by using ATP as an energy source. Our strategy utilizing RecA protein enables dsDNA to be directly hybridized to the capture probes without prior denaturation or single-stranded DNA generation step. In this study, this modified ASLP and RAH method is successfully optimized and demonstrated by analyzing fifteen SNP markers for the cultivar identification of pepper and seven SNP markers for the cultivar identification of rice.
Finally, we introduce the development of ASLP for the detection of sexually transmitted disease (STD) pathogens on DNA microarrays in chapter 4. In the presence of target DNA, two target-specific oligonucleotides which are modified with different universal tag sequences could be ligated. On the other hand, if there is no target DNA, two target-specific oligonucleotides are not ligated. After ligation, separation probe induced extension reaction, and separation of ligated probes from the mixture of genomic DNA and unreacted probes using streptavidin-coated magnetic beads, the separated probes can be amplified with fluorescence labeled universal primers. Finally, amplified PCR products can be analyzed using DNA microarrays supported by RecA mediated highly accurate hybridization. By using the strategy, we are able to successfully detect STD pathogen gene in a single tube reaction with very simple and time-saving steps.
DNA 마이크로어레이는 로봇을 이용해 고체 표면에 마이크로 스케일로 DNA가 배열되도록 제작된다. 각각의 배열된 DNA는 극소량의 DNA 탐침으로 구성되며, 이는 고체 표면에 여러 가지 화학적 반응을 이용해 고정화될 수 있다. DNA 마이크로어레이에는 수백, 수천 개의 DNA 탐침이 집적될 수 있기 때문에 동시에 수많은 유전자 정보를 분석할 수 있다. 따라서 DNA 마이크로어레이 분석 기술은 유전자 발현 분석(gene expression profiling), CGH(comparative genomic hybridization), 단일염기다형성 분석(single nucleotide polymorphism detection), 감염성 원인균 진단(pathogen detection)을 포함한 유전자의 초고속 스크리닝 분석에 널리 사용되고 있다.
PCR 증폭에 의해 생성된 타겟 유전자는 DNA 마이크로어레이에 고정화된 특정 탐침과 수소결합을 통해 상보적인 결합을 이룬다. 특히, 동시에 다양한 유전자 영역을 동시에 분석하기 위해서는 하나의 튜브에서 여러 종류의 프라이머로 다량의 유전자를 증폭하는 다중 PCR(multiplex PCR) 기술이 반드시 수반되어야 한다. 하지만 동시에 증폭하고자 하는 유전자 영역이 많아질수록 프라이머들 간의 교차반응이 발생할 가능성이 높고, 이로 인해 비특이적 증폭 산물이 생성될 가능성이 매우 높다. 이러한 문제를 해결하기 위해 본 연구자는 DNA 마이크로어레이를 이용해 다양한 유전자 영역을 동시에 증폭할 수 있는 새로운 PCR 기술을 개발하는데 성공했다.
두 번째 장에서는 동시에 다수의 단일염기다형성을 분석하기 위한 ASLP (amplification of separated ligation-dependent probe) 기술을 개발한 과정 및 결과를 설명한다. ASLP 기술에서는, 우선 타겟 DNA와 상보적으로 결합하는 부분을 포함한 ASO(allele-specific oligonucleotide) 탐침과 LSO(locus-specific oligonucleotide) 탐침의 대립유전자 특이적 라이게이션(ligation) 반응을 수행한다. ASO 탐침은 공통의forward 프라이머 염기서열(UF)을 5’ 끝에 단일염기다형성 유전자형 분석 영역을 3’ 끝에 각각 포함하는 반면, LSO 탐침은 공통의 분리용 염기서열(US)을 3’ 끝에 포함한다. 이 두 종류의 탐침은 타겟 DNA와 완벽히 상보적으로 결합했을 경우에만 라이게이션 반응에 의해서 연결된다. 공통의 reverse 프라이머 염기서열(UR)과 US에 상보적인 염기서열을 포함하고 5’ 끝에 비오틴(biotin)이 표지되어 있는 분리 탐침이 DNA 중합효소와 함께 라이게이션 결과물에 첨가 한 이후, 연장(extension) 반응을 보내면 연결반응이 일어난 탐침들은 타겟 DNA에서 떨어져 나가게 된다. 그 이후에 스트렙타아비딘 (streptavidin) 이 코팅되어 있는 자성 비드를 사용해 분리과정을 거치게 되면 연결반응이 일어난 탐침들은 미반응 탐침과 타겟 DNA에서부터 아주 손쉽게 분리가 가능하다. 정제된 결과물들은 Cy3형광이 표지된 UF프라이머, 아무런 표지가 없는 UR프라이머와 DNA 중합효소에 의해서 증폭되고 DNA 마이크로어레이를 이용해 분석된다. 이러한 ASLP기술을 사용하여 본 연구자는 고추의 품종 식별용 단일염기다형성 마커를 활용해 15개의 단일염기다형성 마커를 동시에 성공적으로 분석하였다.
세 번째 장에서는 변경된 ASLP 기술과 RAH(RecA-assisted hybridization) 방법을 이용해 단일 튜브에서 동시에 다수의 단일염기다형성을 분석할 수 있는 실험 방법을 구현한 내용을 설명한다. 변경된 ASLP 기술에서는, 첫 번째 공통의 forward 프라이머 염기서열(UF1)을 포함하고 있는 ASOW(allele-specific oligonucleotide wild) 탐침과, 두 번째 공통의 forward 프라이머 염기서열(UF2)을 포함하고 있는 ASOM(allele-specific oligonucleotide mutant) 탐침을 사용해 라이게이션 반응을 진행한다. 그리고 연결반응이 일어난 탐침들을 미반응 탐침과 타겟 DNA에서부터 정제한 이후에, 정제된 결과물을 Cy3형광이 표지된 UF1 프라이머, Cy5형광이 표지된 UF2 프라이머, 그리고 아무런 표지가 없는 UR 프라이머를 사용해 PCR 증폭을 수행한다. 이렇게 변경된 ASLP 기술을 사용하면 두 종류의 단일염기다형성 유전형을 단 하나의 튜브로 분석할 수 있다. 또한 PCR 증폭 산물을 DNA 마이크로어레이에 혼성화 반응을 시킬 때, RecA 단백질을 사용한 혼성화 방법(RAH)을 개발하였다. RecA 단백질을 사용하면 기존의 혼성화 방법보다 열 배 가량 향상된 혼성화 효율을 보였으며, 이로 인해 PCR 증폭 산물의 양이 적을 때에도 충분한 형광 신호를 얻을 수 있었다. RAH방법을 ASLP 기술과 함께 사용함으로써 전체 분석 과정을 단일 튜브에서 수행할 수 있었으며, 이러한 장점을 이용해 15개의 고추 품종 식별용 단일염기다형성 마커와 7개의 쌀 품종 식별용 단일염기다형성 마커를 성공적으로 분석하였다.
마지막 장에서는 ASLP기술과 RAH방법을 이용해 비뇨생식기 감염 원인균 진단을 위한 DNA칩을 개발한 내용을 설명한다. 특정 균의 DNA가 존재하는 경우에는, 그에 해당하는 UF프라이머 염기서열과 US염기서열을 각각 포함하는 두 종류의 타켓 탐침이 라이게이션 반응에 의해 연결된다. 연결된 탐침들은 ASLP 기술에 의해 증폭되고 RAH 방법에 의해 DNA 마이크로어레이를 이용해 분석할 수 있다. 이러한 과정을 통해 본 연구자는 14 종의 비뇨생식기 감염 원인균을 매우 간편하고 빠른 시간 내에 분석하는데 성공했다.
이상의 연구에서 본 연구자는 기존에 없던 새로운 다중증폭기술을 개발하고 성공적으로 구현하는데 성공했다. ASLP 기술과 RAH 방법을 함께 사용함으로써 신속 정확하게 다수의 유전자 영역을 동시에 분석할 수 있었다. 따라서 본 기술은 기존의 DNA 마이크로어레이 분석 기술을 대체할 수 있는 충분한 잠재력을 지니고 있으며, 다양한 분야에서 널리 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
