Photomovement in cyanobacteria is a complex interplay between perception of the directional light of various wavelengths, growth characteristics and external environment conditions. Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Syn6803) has become the model system to study light signal transduction in cyanobacteria and several important players including photoreceptors and other partners have been identified recently. Multiple photoreceptors such as phytochrome-like proteins, BLUF proteins, and signal transduction pathways are involved in cyanobacterial photomovement. However, the dissection of these interacting pathways has not been accomplished yet. Despite considerable advances that were made during the past decades in the field of phytochrome, the mechanisms and photoreceptors that mediate UV/blue light reception have also remained largely unidentified. The work presented in this thesis can provide a clue to identify the UV/blue photoreceptors and the requisite signaling mechanisms.
To elucidate the role of pterin in UV/blue light signal transduction of Syn6803, we analyzed the effects of inactivating the pteridine glycosyltransferase gene (pgtA) on the photomovement of the cyanobacterium Syn6803 under different light conditions. The pgtA mutant displayed abnormal photomovement under UV-A/blue light. Especially, the pgtA mutant showed a negative phototactic response under UV-A (315-400 nm), whereas wild-type did not show any photomovement. Inhibition of pterin biosynthesis by N-acetylserotonin (NAS), an inhibitor of sepiapterin reductase, also inhibited a positive phototactic response of wild-type under white and blue light. In addition, negative phototaxis of the pgtA mutant was observed under UV-A/blue light in the presence of NAS. These results indicated that the product of the PgtA enzyme, cyanopterin, is involved in the inhibition of the negative phototaxis of wild-type by sensing the UV-A. However, 2,4-diamino-6-hydroxypyrimidine-mediated inhibition of GTP cyclohydrolase I, the rate-limiting enzyme for pterin biosynthesis, significantly increased the positive phototaxis toward UV-A in wild-type and pgtA mutant. Furthermore, we measured the action spectrum of phototaxis in vivo for wild-type and pgtA mutant. Maximal activity of wild-type was at 300, 380, and 440 nm, indicating absorption by pterins and flavin. Especially, the UV-A/blue peak at 380 and 440 nm obtained from the action spectrum of phototaxis was found to be closely correlated with the in vitro absorption spectrum previously reported for the cyanobacterial cryptochrome DASH. By investigating the photomovement of wild-type and pgtA mutant to UV and blue light, we suggest that pterin can function as the chromophore of putative UV/blue photoreceptor(s) in cyanobacterial phototaxis.
In addition, the wavelength dependences and fluence rate-response relationships for phototaxis of wild-type and cph2 mutant was investigated in Syn6803. Compared with wild-type, cph2 mutant exhibited maximal activity for positive phototaxis at near UV spectral range. Cysteine to serine substitutions in two GAF domains resulted in a cph2 mutant phenotype under UV-A. pixJ1 mutation was dominant negative to cph2 mutation with respect to UV-A-induced phototaxis. Therefore, these results suggest that cyanobacterial phytochrome Cph2 is essential for the inhibition of positive phototaxis toward UV-A.
Furthermore, we performed the mutational analysis of a novel cyanobacterial phytochrome cph4 and photophysiological experiment with wild-type and cph4 mutants. The cph4::Tn showed no phototactic response to blue light and high intensities of white light, and responded negatively to UV-A depending on the intensity of UV-A. This clearly indicates that Cph4 is clearly involved in sensing the blue light to induce positive phototactic response and also suppressing the negative phototactic response away from UV-A. The cph4::Tn showed negative phototaxis against UV-A and random photomovement under the blue light depending on the light intensity, indicating that they can respond to changes in the intensity of particular wavelengths of light. The photokinesis action spectrum of wild type was also compared with that of cph4 disruption mutants. In contrast to the wild type, Δcph4 were almost completely insensitive to all tested wavelengths. The photokinesis action spectrum of wild-type displayed a strong effectiveness of blue and red light with maximum activity at 420 and 700 nm, respectively. This action spectrum was similar to the absorption spectrum of chlorophyll a, indicating a coupling of photokinesis to photosynthesis. Site-directed mutagenesis of the bilin-binding cysteine in GAF domain inhibited the photokinesis under blue (420 nm) and red (700 nm) light. This clearly showed that the chromophore binding cysteine in GAF domain is needed for Cph4 function and cyanobacterial phytochrome Cph4 is implicated in regulating the photokinesis of Syn6803.
광합성 남세균은 빛을 향한 방향성을 가지면서 활주운동을 하는 주광성을 보인다. 광합성 남세균에서 주광성 활주운동은 다양한 파장의 빛에 대한 반응, 성장특이성 및 외부 환경 조건 사이의 복잡한 상호작용에 의해 나타나는 광생리학적 현상이다. 이를 위해, 남세균은 빛의 방향, 세기, 파장 등을 정교하게 인지하기 위한 광인지 및 광신호 전달 시스템을 보유하고 있다. 남세균 Synechocystis sp. PCC 6803은 광합성 미생물의 빛에 의한 신호 전달과 활주운동에 관련된 단백질들의 역할을 규명하기 위한 모델시스템이 되고 있으며, 최근에 광수용체 및 광신호 전달에 관여하는 수종의 신호 전달 단백질들이 동정 및 분리되었다. 피토크롬 유사단백질, BLUF 단백질을 포함하여 여러 광수용체들과 광신호 전달 매개체들이 남세균의 주광성 운동에 관련되어있다. 그러나, 이들 광수용체와 신호 전달 매개체들 사이의 상호작용에 대한 분자생물학적 메커니즘 및 신호전달경로에 대해서는 지금까지 정확히 밝혀진 바가 없다. 또한 지난 수 십년 동안 피토크롬에 의해 매개되는 광신호 전달은 연구가 많이 된 반면에, 자외선 및 청색광을 인지하는 광수용체와 신호 전달 과정은 아직까지 잘 알려져 있지 않다. 따라서, 본 연구는 자외선 및 청색광을 인지하는 광수용체와 그와 관련된 신호 전달 과정을 규명하기 위한 중요한 실마리를 제공하고자 한다.
광합성 남세균의 자외선 및 청색광 신호전달과정에서 테린(pterin)이 어떠한 역할을 하는지를 규명하기 위해, 시아노테린(cyanopterin) 생합성에 관여하는 pgtA 유전자(slr1166)을 불활성화시켜 파장과 광량의 변화에 따른 pgtA 돌연변이체의 주광성 운동을 분석하였다. 그 결과 자외선 및 청색광에 대한 주광성 반응이 야생형에 비해 달라졌음을 확인하였다. 특히 자외선 하에서 야생형과pgtA 돌연변이체에 대한 군체 수준의 주광성 운동을 조사한 결과, pgtA 돌연변이체는 음성 주광성이 증가한 반면에 야생형은 주광성 운동을 전혀 보이지 않음을 알 수 있었다. Sepiapterin reductase는 남세균에서 바이오테린 $(BH_4)$ 을 합성하는 경로의 마지막 효소이다. Sepiapterin reductase의 활성을 억제하는 NAS (N-acetyl serotonin)를 야생형과 pgtA 돌연변이체에 처리하였을 때, 야생형에서는 자외선 및 청색광을 향한 양성주광성이 억제된 반면, pgtA 돌연변이체의 경우 대조군과는 다르게 음성 주광성이 활발해진 것을 관찰하였다. 이러한 결과로부터 pgtA에 의해 생합성 되는 시아노테린이 야생형에서 음성주광성을 억제하는데 관여함을 추정할 수 있었다. 또한 바이오테린을 발색단(chromophore)로 가지는 단백질이 자외선 및 청색광 신호 전달 경로에서 양성주광성에 관여할 것으로 예측할 수 있었다. GTP-cyclohydrolase I 은 테린 생합성 경로의 첫번째 합성 단계에 관여하는 효소이며, DAHP (2,4-diamino-6-hydroxypyrimidine)는 이러한 GTP-cyclohydrolase I의 활성을 억제한다. 이미 밝혀진 테린 생합성 경로를 근간으로 하여, 야생형과 pgtA 돌연변이체에 DAHP를 처리한 후, 자외선 하에서 주광성 운동을 관찰하였다. 대조군에서 pgtA 돌연변이체는 광량이 높을수록 활발한 음성주광성을 보이는 반면, DAHP 처리를 한 경우에는 활발한 양성주광성이 나타남을 확인할 수 있었다. 또한 야생형의 경우도 DAHP를 처리한 세포들은 활발한 양성주광성을 보였다. 한편, 야생형과 pgtA 돌연변이체 각각에 대해 광량별로 특정 파장의 빛을 조사한 후, 단세포 수준에서 주광성 활성 스펙트럼을 측정하였다. 야생형의 활성 스펙트럼은 300, 380 nm와 440 nm에서 최대 흡광 피크를 보였다. 이러한 활성스펙트럼은 테린 발색단과 플라빈 발색단이 자외선과 청색광에 의해 유도되는 주광성운동에 관련되어있음을 의미한다. 특히, 주광성 운동의 활성 스펙트럼은 이전에 보고된 남세균 크립토크롬 DASH의 생체내 흡수 스펙트럼과 매우 유사하였다. 본 연구는 자외선과 청색광에 대한 야생형과 pgtA돌연변이체의 주광성운동을 조사함으로써, 테린이 남세균의 주광성 활주운동에서 자외선을 흡수하는 발색단으로서 작용할 수 있다는 가능성을 제시 해 준다.
또한, 야생형과 남세균 피토크롬cph2 돌연변이체 각각에 대해 광량별로 특정 파장의 빛을 조사한 후, 단세포 수준과 군체 수준에서 주광성 운동 양상을 분석하였다. 특히, 자외선 하에서 cph2 돌연변이체의 양성 주광성이 야생형에 비해 크게 증가되었음을 관찰하였다. 따라서, Cph2 단백질이 생체 내에서 자외선에 대한 양성주광성을 억제하는데 필수적이라는 것을 알 수 있었다. 2개의 빌린 (bilin) 발색단과 결합하는 시스테인을 세린으로 치환한 cph2 점 돌연변이체(c129s와 c1022s)의 유전자를 cph2 돌연변이체에 형질전환 시켰을 경우, 자외선 하에서 cph2 돌연변이체가 야생형 표현형으로 회복되지 않고 cph2 돌연변이체와 유사한 양성 주광성을 나타내었다. 이는, Cph2 단백질에서 N-말단과 C-말단의 GAF 도메인의 시스테인에 결합하는 2개의 발색단 모두가 자외선에 대한 양성주광성을 억제하는데 필수적이라는 것을 의미한다. 자외선 하에서 pixJ1 돌연변이체와 cph2 돌연변이체 사이의 상호작용을 알아보기 위해, 야생형, cph2/pixJ1 이중 돌연변이체, pixJ1 돌연변이체 및 cph2 돌연변이체의 광운동 양상을 비교하였다. pixJ1 돌연변이체는 자외선에 대해 음성 주광성을 나타내었고, cph2 돌연변이체는 양성주광성을 나타내었으며, cph2/pixJ1 이중 돌연변이체는 pixJ1 돌연변이체의 음성 주광성보다는 약한 음성 주광성을 나타내었다. 이는, 자외선 하에서 pixJ1 돌연변이체가 cph2 돌연변이체에 비해 우위적으로 작용하며 pixJ1이 cph2보다 자외선에 의한 광신호 전달 경로의 하위에 있음을 의미한다. 따라서Cph2 단백질 및 PixJ1 단백질은 자외선에 의해 유도되는 광신호 전달을 조절하는 자외선-특이적 광수용체로 작용할 수 있음을 알 수 있었다.
그리고 Tn5 돌연변이체에서 발굴된 남세균 피토크롬단백질중의 하나인 Cph4단백질이 광신호 전달 과정에 관여하는지를 알아보기 위해 백색광, 자외선 및 청색광 하에서 군체 수준의 주광성 운동을 조사하였다. 백색광과 청색광의 광량이 높아지면, cph4::Tn 돌연변이체는 야생종에 비해 빛에 대한 방향성과 운동성이 감소하는 경향을 보였으며 자외선 하에서는 야생종과는 다르게 빛의 세기가 증가함에 따라 음성 주광성이 활발해짐을 관찰할 수 있었다. 따라서 cph4 유전자는 청색광 하에서 양성 주광성에 관여하며, 자외선에 대한 음성주광성을 억제한다고 볼 수 있으므로 Cph4단백질이 광신호 전달에 직접적으로 관여함을 추정할 수 있었다. 또한 야생형과 cph4 돌연변이체들의 광활동 활성스펙트럼을 분석하여 비교한 결과, cph4 돌연변이체들의 광활동성이 야생형에 비해 크게 감소 되었음을 알 수 있었다. 야생형과 cph4 돌연변이체의 광활동성 운동에 대한 비교 활성스펙트럼은 광합성색소체 중의 하나인 클로로필(chlorophyll a)의 흡수스펙트럼과 상당히 유사하였으며, 청색광 (420 nm) 과 적색광 (700 nm)에서 최대 흡광 피크를 보임을 확인하였다. 이러한 결과는 남세균의 광활동성 운동반응에 클로로필과 같은 광합성색소체를 비롯하여 광합성기구들이 관련되어 있음을 의미한다. 빌린 (bilin) 발색단과 결합하는 시스테인을 세린으로 치환한 cph4 점 돌연변이체(c280s)의 광활동성운동은 청색광(420 nm) 과 적색광(700 nm)하에서 야생형에 비해 현저히 감소되었다. 이러한 결과로부터 Cph4단백질의 GAF 도메인에 존재하는 시스테인이 남세균의 광활동성운동 반응에서 Cph4기능에 필수적이라는 사실을 알 수 있었으며 Cph4단백질이 남세균의 광활동성 (photokinesis)를 조절하는데 관련되어 있음을 예상할 수 있었다.
