A diamine is a chemical that contains two amino groups. Diamines are important raw materials with wide applications in the nitrogen containing chemical industry. For instance, they have been used in the production of pharmaceuticals, agrochemicals, surfactants and other additives. The linear carbon chain diamines with 3 to 5 carbon atoms are particularly interesting. Therefore, this thesis aims to the production of C3 1,3-diaminopropane, C4 1,4-diaminobutane (also referred to as putresine), and C5 1,5-diaminopentane (also referred to as cadaverine).
Currently, the three diamines are industrially produced mainly from chemical synthesis. The chemical routes are undesirable from an environmental standpoint. Therefore, there exists substantial need for biotechnological production of those diamines. Here, the bacterium Escherichia coli was engineered to overproduce the diamines from a renewable carbon source (glucose). The thesis focuses on putrescine because it is most important in terms of the market.
Putrescine is a natural product found only inside the cells of wildtype E. coli at physiological levels (approximately 30 millimolar). High-titer production of putrescine in the culture media has been achieved through rational pathway design and systems metabolic engineering of E. coli. First, a base strain was constructed by inactivating the putrescine degradation and utilization pathways, and decreasing the metabolic flux through the bypass pathway (arginine biosynthesis). Next, ornithine decarboxylase, which converts ornithine to putrescine, was amplified by a combination of plasmid- and chromosome-overexpression of the coding genes. Furthermore, the ornithine biosynthetic genes (argC-E) were overexpressed from the strong trc promoter through genome engineering. Finally, the global regulator of the general stress response, RNA polymerase subunit RpoS, was deleted. The final engineered E. coli strain produced putrescine with a yield of 0.17 g per gram of glucose, and a titer of 24.2 g/L in the culture medium of a fed-batch cultivation.
1,3-Diaminopropane is a natural product found only in the pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii. The pathogenicity limited metabolic engineering of the two native producers for the overproduction of 1,3-diaminopropane. The 1,3-diaminopropane biosynthesis pathway in A. baumannii was functionally introduced into E. coli. Further strain improvement was realized through the rational strategies.
Cadaverine is also a natural product found only inside the cells of wildtype E. coli. For the production of cadaverine, lysine decarboxylase was overexpressed and further improvement was realized through the rational strategies.
In summary, these improvements make up a new starting point for the construction of more efficient industrial strains for diamine production in E. coli.
Diamine은 두 개의 amino group을 가지고 있는 화합물로서, 질소를 포함하는 화합물의 화학 산업에 널리 응용되는 중요한 물질이다. 예를 들어, diamine은 의약품, 농약, 계면활성제과 그 외에 다른 첨가제의 생산에 사용되어 왔다. 특히 3-5개의 탄소를 포함하는 선형 탄소 사슬을 가진 diamine은 주목할 만하다. 따라서, 이번 thesis는 C3 1,3-diaminopropane, C4 1,4-diaminobutane (또는 putrescine), 그리고 C5 1,5-diaminopentane (또는 cadaverine)의 세 가지 물질 생산을 다루고자 한다.
현재, 이 세 가지 diamine의 산업적 생산은 주로 화학적 합성에 의존하고 있는데, 이러한 방법은 환경적 측면에서 볼 때 바람직하지 않다. 따라서 이러한 diamine의 생물 공학적 생산이 매우 중요하다. 우리는 이 논문에서, 대장균이 재생 가능한 탄소원인 포도당으로부터 diamine을 과량 생산하도록 조작하였다. 이번 thesis는 putrescine에 초점을 맞추고 있는데, 그 이유는 시장적 측면에서 가장 중요한 부분을 차지하고 있기 때문이다.
Putrescine은 생리학적 수준에서, 야생형 대장균에서도 오직 세포 내에서만 발견되는 자연적 산물이다 (약 30 millimolar). 배양 배지에서 putrescine의 높은 적정량 생산은 이론적인 경로 설계와 대장균의 시스템 대사 공학을 통해 이루어져왔다. 우선 기본 균주는, putrescine의 분해와 사용 경로의 비활성화와 보조 경로 (arginine 바이오합성)를 통한 metabolic flux 감소에 의해 설계되었다. 그런 다음 coding gene의 plasmid- 와 chromosome-overexpression의 조합에 의해, ornithine를 putrescine로 전환하는 ornithine decarboxylase가 증폭되었다. 더불어 게놈 공학을 통해, 강한 trc promoter로부터 ornithine 바이오 합성 유전자 (argC-E)가 overexpression 되었다. 최종적으로, 일반적인 스트레스 반응의 전반적 조절 인자인 RNA polymerase subunit RpoS가 제거되었다. 이렇게 조작된 최종 대장균은 포도당 1 g 당 0.17 g 의 수율로 putrescine을 생산하였으며, fed-batch 배양 시의 배양 배지에서 24.2 g/L 의 적정 농도를 보였다.
1,3-Diaminopropane은 오직 병원성 세균인 Pseudomonas aeruginosa 와 Acinetobacter baumannii 에서만 발견되는 자연적 산물이다. 이러한 병원성의 특징 때문에, 이 두 가지 세균이 1,3-diaminopropane을 과량 생산하도록 대사 공학적으로 조작하는 데에 어려움이 있었다. A. baumannii 의 1,3-diaminopropane 바이오합성 경로가 대장균에 기능적으로 도입되었다. 이론적 전략을 통해 볼 때, 앞으로의 균주 개발이 더 요구된다.
Cadaverine 또한 야생형 대장균에서도 오직 세포 내에서만 발견되는 자연 산물이다. Cadaverine을 생산하기 위해 lysine decarboxylase가 과발현되었고, 앞으로의 개발이 더 필요하다.
요약하면, 우리가 고안한 이러한 개선 방법이, 대장균에서 diamine을 더 효율적으로 생산하는 산업적 균주을 구축하는 데에 초석이 될 수 있다는 것이다.
