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Development of cancer diagnostic techniques based on = 회전환 증폭 및 바이오바코드 어세이를 통한 암 진단방법에 관한 연구
서명 / 저자 Development of cancer diagnostic techniques based on = 회전환 증폭 및 바이오바코드 어세이를 통한 암 진단방법에 관한 연구 / So-Yi Chung.
저자명 Chung, So-Yi ; 정소이
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2014].
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초록정보

Over 500,000 deaths were caused by cancer in 2011 alone. Likewise, cancer resulted in about 13% of all human deaths worldwide, and the rates are rising as human life expectancy increases. As a result, researches on diagnosis of cancer with several examinations such as X-ray, computed tomography (CT) scan, magnetic resonance imaging (MRI), biopsy, and bone marrow aspiration have been investigated. However, these are all labor-intensive, expensive, and complex. Therefore, many efforts have recently been dedicated to transform the conventional cancer diagnosis methods into much simpler, cost effective, and faster systems to detect cancer in an early stage. In this thesis, we focused on the development of effective cancer diagnosis methods using two different approaches. In the first part, we developed a molecular diagnostic tool based on the rolling circle amplification (RCA) reaction to identify multiplex single nucleotide polymorphism (SNP) of the cellular tumor antigen p53 (tp53) gene in the breast cancer. We utilized RCA reaction to allow highly sensitive and specific SNP detection. The PCR amplicons ranging from 100 to 160 bp were prepared by eleven sets of template primers for RCA template. Then, eleven pairs of padlock probes were designed for simultaneous detection of targeting SNP loci. The SNP sites were from exon 1, 6, 11, and intron 1, 3, 10 of tp53 gene. The 3’ end of padlock probe was designed as complementary SNP site depending on wild or mutant genotype. A healthy donor’s genomic DNA was analyzed and the elongated RCA products were detected under gel electrophoresis. The genotype of donor was confirmed to be all wide type for selected SNP site only with 0.5 ng of RCA template. We could successfully identify the genotype of SNP in 3 hour including 1.5 h of ligation and 1.5 h of RCA. Thus, we developed RCA reaction system for simple, rapid, sensitive, and multiplex SNP detection for early diagnosis of cancer. In the second part, we demonstrated the sensitive circulating tumor cell (CTC) detection based on the biobarcode assay and the micro capillary electrophoresis (μCE). Since there are only 1~10 CTCs per 7.5 ml of whole blood, the development of a highly sensitive detection method for CTC is required. To address this issue, we combined biobarcode assay which potentially enables single cell level detection and μCE technology which can separate target DNAs based on their size with high speed and sensitivity. Thus, through the combination of biobarcode assay and μCE technology, sensitive and multiplex detection of CTCs is available. We selected two targets, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) and CDX2 for distinguish colorectal cancers from other cancer cells. The size of the barcode DNA stands were controlled depending on the biomarkers: 20 bp for EpCAM and 30 bp for CDX2. Thus, two positive peaks (EpCAM and CDX2) indicate colorectal cancer (SW620) cells, while only one positive peak (EpCAM) indicates other cancer type, which is a breast cancer (MCF 7) cell in this case. The bracket ladders comprising 15 and 45 bp were also introduced with the target barcode DNAs to differentiate the length of DNA strands depending on the ratio of elution time. The peak for EpCAM, confirming CTCs was detected at 113 s elution time and the peak for CDX2 was detected at 123 s. The limit of detection of MCF-7 was 10 cells. Thus, the biobarcode DNA assay combined with a μCE system demonstrated highly sensitive, rapid, and multiplex biomarker detection for future point-of-care system in medical applications.

최근 암으로 인한 사망률이 증가하면서 전 세계적으로 암에 대한 연구가 빠르게 증가하고 있는 추세에 있다. 현재로서는 MRI, CT와 같은 값비싼 기계를 가지고 전문적인 인력을 이용한 검사만이 진행되고 있어 조기진단 및 경과 관찰에 있어 가격, 속도 면에서 개선된 민감도 및 특이성이 향상된 분석기법 개발이 절실하다. 본 논문에서는 두 가지 방법으로 암을 진단하고자 하였다. 우선 단일염기다형성(이하, SNP)를 분석하고자 등온 중합효소연쇄반응법(PCR)의 한 종류인 회전환 증폭 방법(RCA)을 이용하였다. 유방암과 깊은 관련이 있는 tp53유전자의 엑손(exon) 1,6,11 와 인트론(intron) 1,3,10 내에서 총 11개의 SNP 위치를 표적으로 실험을 진행하였다. 각각의 RCA 주형은 22개의 프라이머로부터 PCR 증폭법을 이용하여 합성되었으며 이 주형을 기반으로 RCA를 진행하였다. Padlock 프로브의 3’ 끝부분에 각 형질에 맞는SNP를 디자인하였고 주형물과 padlock 프로브의 염기서열이 한 개도 빠짐없이 100% 일치하였을 때에만 리가아제에 의해 원형의 padlock 프로브가 합성되었다. 다음과 같은 원형의 padlock 프로브가 RCA 반응을 통해 단일 염기의 긴 가닥이 만들어졌다. 실험 결과, 건강한 기부자의 SNP는 모두 wild 타입으로 검출되었다. 위 방법을 이용해 3시간 만에 정확한 검출이 가능함을 보였다. 두 번째로, 혈중 순환 암세포를 분석하기 위해 모세관 전기영동과 바이오바코드 어세이를 결합한 시스템을 구축하였다. 혈중암 순환 세포는 10억개 중에 1개가 존재할 만큼 극소량으로 존재하는 세포이기 때문에 특히 높은 민감도를 가진 정확한 검출방법이 필요하다. 우리는 세포 한 개를 직접 관찰하기 보다 간접적으로 barcode DNA를 검출함으로써 보다 높은 민감도를 보이는 바이오바코드 어세이 방법을 사용하였고 이를 통해 10개의 유방암 세포에서도 신호를 검출할 수 있었다. EpCAM항체와 CDX2 항체 두 가지를 사용하여 각각 20bp, 30bp 의 DNA 를 표지 하였다. 20bp 의 DNA는 CTC인지를 확인하는 바이오마커로서 사용되었고, 30bp 의 DNA는 대장암 세포에만 특이적으로 붙는 바이오마커를 결합시켜 암세포의 종류를 검출하고자 하였다. 대장암 세포를 이용하여 모세관 전기영동에서 DNA 신호를 관찰하였고 20bp와 30bp에서 모두 신호를 검출할 수 있었다. 프로브의 혼합부터 검출까지 총 3시간 만에 정확한 검출이 가능하였다. 이 기술은 앞으로 다른 랩온어칩 기술에 융합되어 식품, 범죄, 의료 등 다양한 활용분야로 확대될 것으로 기대된다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {MCBE 14019
형태사항 v, 34 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 정소이
지도교수의 영문표기 : Tae-Seok Seo
지도교수의 한글표기 : 서태석
학위논문 학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 생명화학공학과,
서지주기 References : p. 27-30
주제 cancer diagnosis
single nucleotide polymorphism
rolling circle amplification
circulating tumor cell
biobarcode assay
capillary electrophoresis
암 진단
단일염기다형성
회전환 증폭
혈중 순환 암세포
바이오바코드 어세이
모세관 전기영동
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