Electroporation is a highly efficient molecules delivery method used for transformation in various cell types. However, in microalgae, there has been a lack of optimized electroporation parameters due to the presence of the cell wall, difficulties in protoplast preparation and maintaining cell viability. Therefore, this study was carried out to optimize the electroporation condition for transforming microalgae. Chlamydomonas reinhardtii strains of wild type (CC-124) and mutant (cell wall deficient) were used to investigate the effects of differently sized molecules, calcein (623 Da) and fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran, 40 kDa), and applied to a wide range of electroporation parameters, voltage, and pulse length on cell viability and molecules uptake. In terms of viability, there was no significant difference in both strains on the applied electroporation parameters. In the case of small-sized molecules delivery, the effect of the cell wall was insignificant, as 1.25 kV/cm and 30 ms showed the highest efficiency for both strains, while the bigger-sized molecules were delivered well at 1.5 and 2.0 kV/cm and 30 ms for mutant and wild types, respectively. The optimized parameters of 1.5-2.0 kV/cm and 20-30 ms were used to deliver plasmid DNA (PtCrCFP) into wild-type, and it was observed that 1.25 kV/cm and 15 ms resulted in maximum transformants. Furthermore, it was found that cell viability had a more critical role than molecular delivery in gene transformation from the fact that a lower electric field revealed the highest electroporation efficiency. The integration and expression of PtCrCFP gene were examined, which revealed the existence of some hindrance to stable gene incorporation and fluorescent emission. The percentage of PtCrCFP gene integration and expression was 54.5 % (±4.42) and 8.6 %, respectively. The size of the plasmid (6 kbp) seemed to cause the low integration efficiency, and it was assumed that a strong chlorophyll background of CC-124 provoked the low expression level. Another micro-algal species, Nannochloropsis salina, was investigated to find the optimum electroporation conditions. The rigid cell wall of N. salina prevented efficient molecules uptake by varied electroporation parameters with chemical and enzymatic pretreatment. Hence, it was found that electroporation for molecules delivery in N. salina is inefficient.
화석연료의 고갈과 지구온난화, 환경오염 문제가 심각해짐에 따라, 재생가능하고 지속적으로 개발 가능한 신재생 에너지에 대한 관심이 계속되어 왔다. 다양한 친환경 에너지 중에서도 바이오 에너지는 재생가능하고 탄소 중립적이라는 특성을 가지고 있는 데다가, 유일하게 연료를 생산해낼 수 있는 자원이다. 이에 따라 다양한 생물 자원을 이용한 고효율 연로를 생산하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
관련하여 본 연구에서는 빠른 생장성과 높은 지질 함유량으로 바이오디젤의 원천으로써 주목 받고 있는 미세조류의 유전 형질을 전환하여 바이오 디젤 생산 효율을 높이고자 하였다. 이에 간단한 조작법과 높은 형질 전환 효율을 가지고 있어 널리 쓰여온 전기천공법 (electroporation)을 이용해 미세조류에 적용 가능한 전기적 범위를 탐색하여 적용해보았다. 유전자가 전달되고 발현되는 과정에서는 복잡한 생물학적 단계들이 개입되므로, 순수한 전기적 조건에 따른 영향만을 알아보기 위해 단순 형광물질을 이용해 전달 연구를 수행하였다. 먼저, 모델 미세조류 종인 Chlamydomonas reinhardtii 중 세포벽이 없는 돌연변이 종과 세포벽이 있는 야생 종에 크기가 다른 두 가지 형광물질인 calcein (623 Da)과 FITC-dextran (40 kDa)을 전달했다. 세포벽과 물질의 사이즈가 효과적인 전달의 방해요인이었지만, 전기적 세기가 커질수록 많은 물질을 세포 내로 전달하는 것이 가능했다. 하지만 높은 전기 충격은 많은 세포의 죽음을 야기했기 때문에 이 둘의 상반되는 경향성을 조정하여 최적화할 필요가 있었다. 이에 따라 세포 생존율과 물질 전달율을 곱하여 최적의 전기천공법 전기적 조건을 탐색하였다. 본 조건을 plasmid PtCrCFP를 이용해 유전체 전달에 적용하였다. 그 결과, 찾은 조건 범위보다 낮은 값에서 가장 높은 유전 형질 전환 효율이 얻어졌고, 이는 유전체가 전달된 세포가 다시 살아남아 자라야 때문에 세포 생존율이 물질 전달율보다 더 큰 영향을 끼쳤기 때문인 듯하다. 이후 PtCrCFP 유전체의 결합과 발현 또한 분석하였는데, 본 유전체의 사이즈와 야생 종 자체의 낮은 발현 효과로 인해 모든 형질전환주에서 해당 유전체의 결합과 발현이 확인되지 못했다. 정확한 원인을 밝혀내기 위해서는 더 다양한 분석이 요구된다.
추가적으로 높은 상업적 가치로 인해 주목 받고 있는 종인 Nannochloropsis salina에 적용 가능한 전기천공법 조건을 앞선 방법을 이용해 탐색하였다. 해수종인 N. salina는 작은 크기에다가 매우 단단한 세포벽을 형성하고 있기 때문에 물질 전달이 가능한 조건을 찾는 데에 어려움이 있었다. 이를 극복하기 위해 세포벽 전처리를 시도하였으나, 이 역시 좋은 결과를 얻기엔 역부족이었다. 굉장히 높은 전기 충격에도 전달 효과를 보지 못하였기에, 다른 세포벽 전처리 방법 또는 전기적 세기 외의 다른 환경적 요소들에 변화를 줌으로써 본 종에 물질을 전달할 수 있는 전기천공법 조건 확립과 더 나아가 효과적인 유전 형질 전환을 이룩할 수 있기를 기대한다.
정리하자면, 전기천공법은 효과적인 미세조류 형질 전환 방법으로써의 효용성이 크지만 형질 전환을 하고자 하는 종에 따른 조건이 매우 다르므로 이에 따른 최적화가 요구된다. 전기적 조건 외에도 영향을 주는 요소들이 많기 때문에 다양한 접근법에서의 시도가 필요할 것이고, 이 것이 확립된다면 다양한 미세조류 종을 전기천공법을 통해 유전 형질 전환을 성공시켜 바이오디젤 생산성을 크게 향상시킬 수 있을 것이다.
