In many researches, the importance of N-linked glycans in EPO has been reported which affect the solubility, cellular processing, secretion, and in vivo metabolism. Especially, the terminal sialylation levels of rhEPO are the most important factor for pharmacokinetics. The removal of sialic acid was correlated with significantly decrease of serum half-life and lower biological activity. Thus, to achieve the complete tetra-antennary and tetra-sialylated N-linked glycans in rhEPO is one of the most important goals to produce the high quality of EPO.
GSLs are abundant in plasma membrane, and they contatin various carbohydrate components such as sialic acid. CMP-sialic acid, a precursor of sialic acid, is synthesized by CMP-sialic aicd synthase and transported to Golgi apparatus. After that, CMP-sialic acid is used in sialylation of GSLs and glycoproteins. If the biosynthesis of GSLs is inhibited, unused CMP-sialic acid would lead to increase sialylation of glycoprotein such as EPO.
Thus, in this study, to increase sialylation of rhEPO in Chinese hamster ovary cells , the biosynthesis of GSLs is inhibited by treating competitive inhibitor and introducing siRNA.
EtDO-P4, inhibitor of ceramide glucosyltransferase, was treated to EC2-1H9 cells to interfere the first step in formation of glycosphingolipids. The analyses of GSLs and EPO sialylation in EtDO-P4 treated CHO cells showed that EtDO-P4 treatment clearly reduced the expression of major GSLs and increased lectic blotting intensity of sialic acid about 22% than untreated rEPO.
Small interfering RNA(siRNA) transiently interferes the expression of specific genes with complementary nucleotide sequence. So, we found mRNA sequence of CGT and synthesized siRNAs. We found that the siRNAs have effect on inhibiton of expression of the CGT gene. The analysis of GSLs showed that biosynthesis of GSLs was significantly reduced by siRNAs treatment. In the lectin blotting for analyzing sialylation level of EPO, the band intensity of siRNA treated CHO cells was increased about 20% than untreated CHO cells.
Because of transient expression of siRNA, it requires use of expression vector to produce siRNA in CHO cells stably. So, we contructed shRNA vector, pCGT_miR and transfected CHO cells with the vector. In RT-PCR and TCL analysis, transfection with pCGT_miR showed the effective ability to inhibit expression of CGT gene and GSLs. Also, sialylation of rhEPO in shRNA treated CHO cells increased by 21.6% compared to that of control CHO cells.
많은 연구들에서 조혈모세포 자극인자(EPO)의 수용성,분비,생체 내 대사과정에 영향을 미치는 N-당쇄의 중요성이 보고되어져 왔다. 특히, 인간유래재조합 EPO의 당쇄말단 시알산의 함량은 약리활성학에서 가장 중요한 요인이다. 당쇄말단의 시알산의 제거는 생체 내 반감기와 생리활성의 상당한 감소와 연관된다. 따라서, rhEPO의 완전한 tetra-antennary 구조와 tetra-sialyalted된 N-당쇄는 높은 품질의 EPO를 생산하기 위한 가장 중요한 목표이다.
Glycosphingolipids(GSLs)는 세포막에 많이 존재하며, 시알산과 같은 다양한 당 구성요소들을 포함한다. 시알산의 전구체인 CMP-sialic acid는 CMP-sialic acid synthase에 의해 합성되어 골지체로 수송된다. 이후, CMP-sialic acid는 GSLs과 당단백질들의 시알산화에 사용된다. 만일 GSLs의 생합성이 억제된다면, 사용되지 않은 CMP-sialic acid는 EPO를 포함하는 당단백질들의 시알산화의 증가를 유도할 것이다.
따라서, 이 연구에서는 CHO세포에서 rhEPO의 시알산화를 증가시키기 위하여 경쟁적 저해제의 처리와 siRNA의 도입을 통하여 GSLs의 생합성을 저해시켰다.
ceramide glucosyltransferase(CGT)의 경쟁적 저해제인 EtDO-P4는 GSLs 합성의 가장 첫 단계를 방해하기 위하여 EC2-1H9 세포에 처리되었다. EtDO-P4가 처리된 CHO세포에서 GSLs와 EPO의 시알산화의 분석결과, EtDO-P4의 처리가 주요 GSLs의 발현을 상당히 저해시켰으며 EtDO-P4를 처리하지 않은 세포에 비해 EPO 시알산의 lectin blotting intensity를 약 22% 증가시켰다는 것을 보여주었다.
siRNA는 상보적인 핵산 염기 서열의 특정 유전자의 발현을 일시적으로 방해한다. 따라서, 이 연구에서는 CGT의 mRNA 염기서열을 확보하여 siRNA를 제작하였다. 본 연구에서는 GSLs의 생합성이 siRNA 처리에 의하여 상당히 감소하였음을 보여주었다. EPO의 시알산화 함량 분석을 위한 lectin blotting에서, siRNA가 처리된 CHO세포의 band intensity가 처리되지 않은 세포에 비하여 약 20% 증가하였다.
siRNA의 일시적인 발현때문에, CHO세포에서 안정적으로 siRNA를 생산할 수 있는 발현 벡터의 사용이 필요하다. 따라서, 본 연구에서는 pCGT-miR이라는 shRNA 벡터를 제작하였고 CHO 세포내로 도입시켰다. RT-PCR과 TLC 분석에서, pCGT-miR의 도입은 CGT유전자 발현과 GSL의 발현의 억제에 효과가 있음을 보여주었다. 또한, shRNA가 도입된 CHO세포에서의 rhEPO의 시알산화 역시 control CHO 세포와 비교하였을 때 약 21.6% 증가하였다.
