Circulating rare cells in blood provide valuable information and their separation can open opportuni-ties for biological studies. Separation of circulating tumor cells (CTCs) in specific can be used as a non-invasive liquid biopsy and biomarker for cancer diagnosis and screening purposes. CTCs are generally larger than white blood cells (WBCs) and many size-based separation methods utilizing inertial microfluidics for high throughput separation have been developed in recent years. However, due to the overlap in size distribu-tions between WBCs and CTCs, it has been difficult to separate with both high recovery rate and purity. In this study, to overcome the limitation of size-based inertial separation of CTCs from WBCs, immunospecific size enhancement was applied to eliminate that size overlap. To demonstrate improved separation, mi-crobeads are attached to CTCs by antigen-antibody binding to enhance their sizes, and then separated from WBCs in an inertial microfluidic separating device that consists of a series of contraction-expansion arrays (CEA). In addition, the dimensions of CEA device were systematically varied for optimal separation performance and computational fluid dynamics simulations were performed to characterize the secondary flows in the device. Breast cancer and monocyte cancer cell lines were chosen to model CTCs and WBCs inertial migration in the optimized device, respectively, and then breast cancer cells were labeled with beads to compare the separation performance. The device separates unlabeled CTCs from WBCs with 74% recovery rate and 76% WBC rejection ratio at 0.88 ml/h. However, increased recovery rate of 97.6% and 95% WBC rejection ratio at 0.88 ml/h was demonstrated by labeling the CTCs with 5 μm beads. With increased recovery rate and purity provided by increased WBC rejection ratio, inertial separation of bead-labeled CTCs not only has the potential to improve the clinical diagnostic, prognostic and screening results, but also to provide invaluable opportunities for rare cell researches, including hematopoietic stem cell, cancer metastasis, and cancer gene mutation studies
본 연구에서는 세포와의 마이크로입자 결합을 이용하여 미세유체소자 기반의 혈중암세포 분리기술 효율을 높였다. 혈중암세포를 모델하기 위해 MCF-7세포주가 사용되었고 백혈구를 모델하기 위해 U937세포주가 사용되었다. U937 세포주는 백혈구중에서도 크기가 큰 세포들을 모델하기 위해 선택되었으며 각 세포주의 크기 측정을 통해 두 세포주의 크기분포가 겹친다는 사실을 확인하였다. MCF-7세포표면에 3 혹은 5 μm 지름의 마이크로입자를 부착함으로써 그들의 증가된 크기를 관찰하였고, 5 μm 지름의 마이크로입자 부착을 통한 전체적인 크기증폭은 U937세포주와의 크기분포오버랩을 제거한다는 사실을 확인하였다.
미세유체채널은 photolithography기술을 이용하여 제작된 폴리다이메틸실록세인 몰드와 유리 슬라이드로 결합되어 완성되었다. 제작된 미세유체소자는 2개의 주입구 (샘플 주입구와 버퍼 주입구)와 2개의 유출구 (샘플 유출구와 폐액 유출구)를 가지고 있으며 주입된 샘플은 확장-축소 영역이 반복되는 미체채널을 통해 흘러가며 크기별로 분리된다. 전산수치 해석방법을 통해 미세채널내에서의 이차유동장 형성을 확인하였으며 유동장으로 인해 발생하는 항력과 이차유동장의 회전속도는 주입되는 유량에 비례하여 증가한다는 것을 확인하였다.
재작된 채널내에서의 형광 마이크로입자의 거동을 통해 세포분리에 최적화된 확장-축소영의 수와 축소영역의 길이를 결정하였다. 4, 15, 25 μm 지름의 형광 마이크로입자들이 최적화 실험에 사용되었는데 각 크기의 입자들은 적혈구, 백혈구, 그리고 5 μm입자가 부착된 혈중암세포를 모델하였다.
최적화된 미세유채소자는 4단의 확장-축소 영역으로 이루어져 있으며 각 축소영역의 길이는 150 μm로 결정되었다. U937과 MCF-7세포주의 거동을 분석한 결과 유속이 높아질수록 미세채널 내에서의 평균 lateral position 차이가 증가하는것을 확인하였다. 5 μm입자가 부착된 혈중암세포를 주입하여서 거동을 Re = 9와 12에서 분석한 결과 그들과 U937세포들의 의 평균 lateral positions차이는 미세입자가 부착되지 않은 MCF-7세포들과 U937세포들의 평균 lateral position차이보다 더 큰것을 확인하였다.
세포 분리 효율은 U937 제거율과 MCF-7 회수율로 평가되었다. U937세포와 마이크로 입자가 부착되지 않은 MCF-7의 분리효율은 세포를 따로 주입하여 각각의 lateral positions을 따로 측정해서 계산되었고 U937 세포와 마이크로입자가 부착된 MCF-7세포의 분리효율은 같이 혼합된 샘플을 주입하여 관찰된 세포들의 lateral positions측정을 통해 계산되었다. 마이크로입자가 부착되지 않은 MCF-7 세포의 분리는 74% U937 제거율과 76% MCF-7 회수율을 보여주었지만 마이크로입자를 MCF-7부착한 경유 U937제거율은 95%, 그리고 MCF-7 회수율은 97.6%로 증가하였다.
본 연구에서 최적화된 샘플 처리량은 하나의 소자사용을 기준으로 하여 0.88 ml/h이지만 5 inch 지름의 웨이퍼 하나에서 재작되는 소자의 최대 수인 34개의 소자를 평행으로 접속시켜 처리량을 29.9 ml/h로 증가시킬수 있다. 실험에 사용된 분리소자는 세포를 소자 내에 고정시키거나 trap시키지 않고 연속적으로 분리 및 회수가능여 다수의 소자를 평행으로 접속시킬 수 있다는 장점이 있다. 하지만 칩내에 세포를 고정시켜 분석하는 소자들의 경우 다수의 소자들을 평행 접속시 세포의 위치를 찾는 시간과 분석시간이 그만큼 길어지고 어려워진다는 단점이 있다.
FACS를 이용한 기존의 세포 분리 방법은 기계가 복잡하고 비용이 많이 들며 숙련된 기술자가 필요하다는 단점이 있다. 하지만 고효율의 미세유체 분리기술의 개발은 세포분리기계의 비용 및 복잡한 기계의 고장으로 인해 생기는 유지비 차감과 연구 작업공간의 소형화 및 쉬운 분리방법을 통해 개선된 세포분리를 가능케 할 수 있다. 본 연구에서 사용된 방법은 분리하고자 하는 세포에 마이크로입자를 부착해야된다는 단점이 있다. 하지만 희귀하게 존재하는 세포분리를 위해 magnetic-activated cell sorting (MACS)를 이용한 샘플 전처리후 FACS를 이용하는 경우들과 비교해 보았을때 본 연구의 마이크로입자 부착은 작은 단점이라 할 수 있다.
본 연구에서 입증된 분리방법은 혈액내에 있는 혈중 암세포 분리를 통한 암 진단, 스크리닝 및 생체검사에 응용될 수 있으며, 회수된 암세포는 분자분석 및 유전자 변이 분석에도 이용가능하기 때문에 암 전이 연구뿐만 아니라 세포 분리를 필요로 하는 많은 연구분야에 응용될 수 있을 것이다.
