We fabricated liver lobule-like stacked hydrogel papers embedded hepatic cells for in vitro liver tissue reconstruction with negligible diffusion limitation. HepG2 cell-embedded mi-cropatterned hydrogel papers which had the width of 8000 μm, the length of 8660 μm and the height of 80-140 μm. The stacked hydrogel papers were fabricated via laminating and aligning the hepatic hydrogel papers in a PDMS jig. For drainage, the jig had many pillars of 170 μm in height. The cells could be cultured in the stacked hydrogel papers which had the height of 300-600 μm exceeding diffusion limit thickness (150-200 μm). The patterned structure with many openings facilitated cell-to-cell interaction and overcame the diffusion limitation, so it gave good viability more than 90% for much remaining HepG2 cells with compared to no pattern. Also, cell-to-cell interaction between each hydrogel paper led to the twofold increase of albumin secretion and the maintenance of urea secretion per million cells with compared to a hydrogel paper. Therefore, we suggest that the stacked hydrogel papers can be macroscale hepatic pseudo-tissues with complex microenvironments, over-coming diffusion limitation for biological study of liver.
간은 해독 작용과 대사 작용 등 신체 내에서 다양한 역할을 하는 장기인 동시에 간세포, 혈관 세포, 면역 세포, 간 성상세포 등이 모여 기본단위인 간소엽을 이루고 이 간소엽들이 모여 하나의 조직을 이루는 복잡한 구조를 가지고 있다. 그로 인해 이식이나 약물 검사 또는 생물학적 연구에 많이 필요하지만 장기 이식에는 한계가 있기 때문에 생체 외 모델의 필요가 증가하는 추세이다. 특히 간 조직의 삼차원 미세환경을 구현하기 위해 수화젤을 이용해 간세포를 배양하는 연구들이 많이 진행되어 왔다. 그러나 수화젤을 이용해 상향식 접근으로 복잡한 간 조직을 구현하고자 할 때는 마이크로 크기의 구조물들을 원하는 대로 조립하기가 어렵다는 단점이 있었다. 또한 수화젤의 부피가 커질수록 내부의 간세포들이 영양분 및 산소의 확산 제약 (150-200 μm)에 의해 수화젤 내에서 세포 괴사가 더 잘 일어나게 된다. 이를 극복하기 위해 위 연구에서는 기존에 알려진 알지네이트 수화젤 종이를 이용하여 확산 제약의 영향을 무시할 수 있는 적층된 수화젤 종이 구조물을 제안하였다.
확산 제약을 극복하기 위해 먼저 간소엽을 모사한 마이크로패턴된 수화젤 종이를 제작하였다. 이 수화젤 종이는 23개의 한 변이 1000 μm인 육각형들로 이루어져 있고 하나의 육각형에는 가운데 구멍과 그 주변을 둘러싸는 수화젤 패턴들 사이에 구멍들이 존재한다. 이 수화젤 종이의 너비는 8000 μm, 길이는 8660 μm이다. 수화젤 종이 내에 HepG2 간세포들을 키웠을 때 수화젤 패턴의 너비에 따라서 세포가 패턴을 따라 자라거나 혹은 패턴 사이의 구멍을 채우면서 자랄 수 있었다. 너비가 150 μm인 패턴으로 수화젤 종이를 제작한 결과, 세포들이 패턴을 따라 잘 자라고 높은 내부 세포 생존율을 보였다.
이어서 제작된 수화젤 종이를 쌓을 수 있는 지그를 제작하였다. 수화젤 종이가 정렬이 되도록 지그의 내부 테두리를 수화젤 종이의 테두리와 동일하게 패터닝하였다. 수화젤 종이가 끝이 잘린 마이크로파이펫으로 버퍼나 배양액에 담겨서 이동하기 때문에 한 장씩 쌓을 때 배수가 되는 지그 제작이 필요했다. 그래서 두 가지 지그를 제작했는데, 첫 번째 지그는 PEG 지그로 확산이 잘 일어나서 배수는 잘 되었지만 잘 부러져서 사용하기 어려웠다. 다음으로 만든 것은 PDMS 지그인데, 확산이 일어나지 않기 때문에 바닥에 마이크로 크기의 기둥들을 만들어 그 사이로 물이 빠져나가도록 제작하였으며 PEG 지그와는 달리 내구성 있게 잘 만들어졌다. 기둥의 높이가 높아질수록 배수가 더 잘 되므로 기둥의 높이를 170 μm로 한 PDMS 지그를 수화젤 종이 적층을 위해 사용하였다.
위의 지그를 이용하여 수화젤 종이를 쌓았을 때 4장을 쌓아도 패턴 및 패턴 사이 구멍들이 잘 정렬이 되었고, 잘 정렬된 구멍들이 적층된 수화젤 종이 내부에 빈 공간을 형성해 넓은 확산 면적을 확보할 수 있었다. 그 뒤에 HepG2 세포들이 내재된 수화젤 종이를 4장씩 쌓아서 300-600 μm 두께의 적층된 수화젤 종이 구조물을 만들었고, 확산 제한 두께를 넘었음에도 불구하고 이 구조물 내부에서 세포들이 90% 이상의 높은 생존율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
더불어서 적층된 세포 내재 수화젤 종이 내부의 패턴의 역할을 관찰한 결과, 패턴이 있을 때가 없을 때보다 살아있는 세포들의 양이 4배 많고 죽은 세포들의 양이 30배 적다는 것을 확인하였다. 이는 패턴된 수화젤 내에서 세포들이 자라면서 패턴이 없을 때에 비해 세포끼리 상호 작용이 많이 일어났기 때문에 많은 세포들이 구조물 밖으로 빠져나가거나 죽지 않고 높은 생존율을 유지할 수 있었던 것으로 보여진다.
이어서 적층된 간세포 내재 수화젤 종이로부터 HepG2 세포의 알부민 및 요소 분비를 측정한 결과, 수화젤 종이 한 장과 비교해 봤을 때 동일한 양의 세포에서 적층된 수화젤 종이에서 의미 있게 더 많은 알부민 분비가 일어났다. 요소 분비 또한 4일째까지는 비슷한 경향을 보이다가 6일째가 되어서 한 장에서는 분비가 상당히 줄어든 것에 비해 적층된 구조에서는 분비가 유지된다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 세포 내재 수화젤 종이가 적층될수록 종이와 종이 사이에서 세포 간의 상호 작용이 일어나 세포의 기능에 더 좋은 영향을 끼친 것으로 보여진다.
많은 수가 적층된 간세포 내재 수화젤 종이 구조물이 간세포가 높은 생존율과 향상된 기능을 가질 수 있도록 돕는 것을 확인하면서 좀 더 큰 규모의 삼차원 간 조직 구현에 한 걸음 다가섰다. 이 수화젤 구조물을 이용하여, 수화젤 종이에 각각 내재된 혈관 세포 또는 섬유아세포를 간세포와 공생배양을 해서 간소엽 내부에 디세강을 구현할 수 있을 것으로 기대된다. 더불어 수화젤의 성분을 달리 해서 이 수화젤 구조물을 질병 모델로도 사용할 수 있을 것으로 기대된다. 그리고 약물 검사 및 기능 검사 등에 이 구조물을 사용하기 위해서는 지그를 마이크로칩으로 이용할 필요가 있는데, 확산에 제약을 주는 지그 내에서 수화젤 구조물 내의 세포 생존율을 높이기 위해서는 미세유체역학을 이용해서 배양액의 계속적인 공급이 필요함을 확인하였다. 그래서 실제 간 내부의 혈액 이동 속도를 고려하여 지그를 가지고 미세 유체 플랫폼을 제작한다면 좀 더 미세 환경을 잘 구성할 수 있을뿐더러 여러 검사들에서 쉽게 사용할 수 있는 장치를 만들 수 있을 것으로 기대된다.
