Influenza RNA polymerase is composed of three subunits, PA, PB1, and PB2, which interact with each other for transcription and replication of the viral RNA genome in the nucleus of infected cells. PB2’s RNA-binding 627-domain (residues 535-693), located in the C-terminus, presents a highly basic surface around residue K627 and has been proposed to interact with viral or cellular factors, resulting in host adaptation. However, the function of this domain is not yet characterized in detail. In this study, I identified RNA-binding activity and RNA-binding surfaces in both the N-terminal and basic C-terminal regions of PB2 using NMR experiments. Through mutagenesis studies, I confirmed which residues directly interact with RNA and mapped their locations on the RNA-binding surface. In addition, by luciferase activity assays, I showed that influenza virus polymerase activity may correlate with the interaction between PB2 and RNA. Representative host adaptive mutations Q591K/R and E627K were found to be located on the RNA-binding surface and were confirmed to directly interact with RNA and to affect polymerase activity. From these results, I suggest that influenza virus polymerase activity may be regulated through the interaction between PB2’s 627-domain and RNA and that consequently host adaptation of the virus may be influenced.
Influenza A viruses are viral pathogens that cause both seasonal influenza epidemics and global pandemics. Although there are effective drugs such as the neuraminidase inhibitors oseltamivir (Tamiflu) and zanamivir (Relenza), influenza virus can have resistance to these drugs by the long-term use. Therefore, new anti-viral drug have to be developed to prevent the epidemic and pandemic by influenza virus. In particular, influenza virus polymerase PA subunit contains the endonuclease activity, which creates a capped RNA primer during viral transcription, and high conserved sequence among influenza strains. On account of this significance, PA endonuclease domain can be a promising target for the development of anti-viral drug. In this study, I applied GO-based assay for evaluating PA endonuclease activity and showed that GO-based inhibition assay for PA endonuclease activity was quantitative using epigallocatechin gallate (EGCG) inhibitor. Therefore, GO-based assay can be applied for screening of the anti-viral drug targeting PA endonuclease.
Fanconi-anemia associated protein 20 (FAAP20) was recently identified as an integral subunit of the fanconi anemia (FA) core complex. The C-terminus of FAAP20 contains an ubiquitin-binding zinc figer 4 (UBZ4) domain, which has been proposed to interact with monoubiquitinated Rev1 for FA core complex-mediated recruitment of Rev1 to the DNA lesion. In this study, I determined the solution structure of FAAP20-UBZ4 domain and identified the interaction between FAAP20-UBZ4 domain and Rev1-BRCT domain using NMR experiment. In addition, I confirmed that FAAP20-UBZ4 domain interacts with ubiquitin, but BRCT domain and ubiquitin do not compete for the binding site on UBZ4 domain. From these results, I suggest that the interaction of UBZ4 with BRCT may provide the specificity for the recruitment of Rev1 into DNA lesion and the interaction of UBZ4 with ubiquitin may enhance the affinity between FAAP20 and Rev1.
인플루엔자 RNA 중합효소는 PA, PB1, PB2의 세가지 단백질로 구성되어 있으며, 이들은 감염된 숙주세포의 핵에서 서로 상호작용하면서 바이러스의 전사와 복제를 위해서 기능을 하고 있다. PB2의 C 말단에 위치하고 있는 RNA 결합 도메인은 627번 라이신 아미노산을 포함하는 부분이 굉장히 basic 하여 바이러스를 구성하거나 숙주세포를 구성하는 요소들과 상호작용하여 바이러스의 숙주적응에 영향을 미칠 것으로 제안되었다. 그러나 아직까지 이 도메인의 기능에 대해서 구체적으로 연구되지 않았다. 이번 연구에서 NMR 실험을 통해 PB2 627 도메인의 N 말단과 basic한 C 말단이 RNA 결합에 관여하는 것을 확인하였고, 돌연변이 도입을 통한 EMSA 실험을 통해 RNA와 직접적으로 상호작용하는 아미노산을 확인하였다. 또한 luciferase activity assay를 통해서 인플루엔자 바이러스의 polymerase activity가 PB2와 RNA의 상호작용과 상관관계에 있음을 확인하였다. 특별히 대표적인 숙주적응변이에 관련된 591번과 627번의 아미노산도 RNA와의 상호작용에 직접적으로 관여하고 polymerase activity에 영향을 미치는 것을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해서 인플루엔자 바이러스 polymerase activity가 PB2 627 도메인과 RNA와의 상호작용을 통해서 조절되며, 결과적으로 바이러스의 숙주적응에 영향을 미칠 것으로 생각된다.
인플루엔자 A 바이러스는 계절형 유행성 독감와 세계적인 유행성 전염병을 야기하는 바이러스 병원체이다. 비록 타미플루나 리렌자와 같은 뉴라미니다아제 저해제가 효과적인 약물로써 사용되고 있지만 장기적으로 사용될 때 이들 약물에 대한 내성 인플루엔자 바이러스가 생길 수 있다. 그러므로 인플루엔자 바이러스의 유행에 대비하기 위해서 새로운 항바이러스제의 개발이 필요하다. 특별히 인플루엔자 바이러스 중합효소를 구성하는 PA 단백질은 바이러스의 전사과정에서 capped RNA 프라이머를 만들기 위한 endonuclease 활성을 가지고 있으며, 이 활성 부위의 서열이 굉장히 보존되어 있기 때문에 PA endonuclease 도메인은 항바이러스제 개발을 위한 중요한 타깃이 될 수 있다. 이번 연구에서는 PA endonuclease 활성을 측정하기 위해서 그래핀 옥사이드 기반 시스템을 도입하였고, PA endonuclease 도메인에 결합하여 활성을 억제한다고 알려진 EGCG 저해제를 이용하여 그래핀 옥사이드 기반 시스템이 정량적인 측정 방법임을 확인하였다. 따라서 PA endonuclease를 타깃으로 하는 항바이러스제 탐색을 위해서 그래핀 옥사이드 기반 시스템이 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
FAAP20 단백질은 FA 복합체를 구성하는 요소로써 최근에 확인되었다. FAAP20의 C 말단부위는 ubiquitin-binding zinc finger 4 (UBZ4) 도메인을 포함하고 있으며, 이 도메인은 monoubiquitinated Rev1과 상호작용하여 DNA 손상 부위에 FA 복합체를 통한 Rev1의 조직화에 관여한다고 제안되었다. 이번 연구에서는 FAAP20-UBZ4 도메인과 Rev1-BRCT 도메인의 상호작용과 UBZ4 도메인과 ubiquitin의 상호작용을 확인하였고, BRCT 도메인과 ubiquitin은 UBZ4 도메인과의 상호작용 부위를 위해서 서로 경쟁하지 않고 분리되어 있는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 UBZ4 도메인과 BRCT 도메인의 상호작용은 DNA 손상 부위에 FAAP20에 의한 Rev1의 조직화를 위해 특이성을 제공해주며, UBZ4 도메인과 ubiquitin의 상호작용은 FAAP20과 Rev1과의 결합 친화도를 증가시켜주는 역할을 할 것으로 생각된다.
