The electrochemical methods are widely used in many sensing research areas. In this dissertation, the electrochemical methods were used to study a sensitive thrombin/DNA detection method using scanning elec-trochemical microscopy (SECM), single wall carbon nanotube (SWCNT) casted glassy carbon electrode, thrombin binding aptamer (TBA) and peptide nucleic acid (PNA).
An electrochemical aptasensor with a thrombin binding aptamer (TBA) was developed using a single wall carbon nanotube (SWCNT) casted GCE. To detect the target molecules, aptamers are currently focused on and the use of aptamers for biosensing is particularly interesting, as aptamers could substitute antibodies in bioanalytical sensing. The SWCNT casted GCE provides a suitable conducting matrix for TBA immobiliza-tion and electrochemical detection. The TBA was immobilized on SWCNTs through π-stacking without any special modification, resulting in helical wrapping to the surface. In the presence of thrombin, the TBA binds with thrombin and the TBA concentration on the SWCNT surface decreases. Therefore, the binding event between the TBA and thrombin results in decreased concentration of the TBA on the SWCNT surface. The remaining amount of TBA can be analyzed by an electrochemical method without any label, which is com-monly used for signal detection and amplification in electrochemical biosensors, because the guanine bases of the nucleic acid are measurable by electrochemical methods. The electrochemical oxidation of guanine nucleotides was enhanced by electrocatalytic mediation using Ru(bpy)32+ for higher sensitivity and reduction of the overpotential for electrochemical detection.
This dissertation describes the novel electrochemical system for protein in sandwich manner by using the aptamers and the scanning electrochemical microscope (SECM). For protein detection, sandwich system is ideal since labeling of the target protein is not necessary. To develop the electrochemical protein sensor sys-tem, thrombin was chosen a target protein since many aptamers for it were already reported and two different aptamers, which recognize different positions of thrombin, were chosen to construct sandwich type sensing system. In order to obtain the electrochemical signal, the glucose oxidase(GOD) used for labeling the detection aptamers since it has large amount of stability in aqueous solution. One aptamer was immobilized onto the gold electrode and the other aptamer for detection was labeled with GOD for generation of the electric signal. Thrombin was detected in sandwich manner with aptamer immobilized onto the gold electrode and the GOD labeled aptamer. The enzymatic signal, generated from glucose addition after the formation of the complex of thrombin, was measured. The generation-collection mode of SECM was used for amperometric H2O2 detection.
Electrochemical DNA sensor employing peptide nucleic acid (PNA) as a probe molecule was developed. Self-assembled monolayer of cysteine linked PNA were spotted on gold electrodes by microarrayer. The nega-tively charged monolayer in the presence of target DNA was investigated by SECM technique using redox marker ions [Fe(CN)6]3-/4-. Electron transfer of [Fe(CN)6]3-/4- on the PNA-DNA hybrid layer was hindered due to the electrostatic repulsion between anion and negatively charged DNA and result in a reduced current as like negative feedback mode of SECM. This technique using SECM scanning is label free method and adapt-able for the high throughput analysis of DNA array. The detection range was from 10 nm to 100 μm of target DNA.
전기화학을 이용한 바이오센서는 전극표면에서 일어나는 전자 전달 반응을 이용하여 생체 환경이나 시료에 존재하는 생물학적 물질을 검출하는 장치로 전통적인 분석 기술에 비해 소형화, 짧은 검출 시간 및 높은 검출 감도, 제작의 용이성을 장점으로 갖고 있다. 최근에는 전기화학적 분석 방법이 더욱 확대되어 다양한 연구에 응용되고 있다. 본 학위논문에서는 전기화학적 방법을 통해 전기화학적 주사현미경(SECM)과 탄소나노튜브, 앱타머, PNA를 이용하여 트롬빈 단백질과 DNA의 검출에 관한 연구를 진행하였다.
앱타머는 단일가닥의 DNA나 RNA로 목표 분자와 선택적인 결합을 할 수 있고 항원-항체 반응에 비해 다양한 장점을 가지고 있다. 특히 특별한 조작 없이SWCNT와 π-π 결합을 통해 서로 결합 가능함이 밝혀졌다. 본 연구에서는 혈액의 응고나 혈관 세포에 중요한 영향을 끼치는 트롬빈과 선택적 결합이 가능한 트롬빈 결합 앱타머(TBA)를 이용하여 트롬빈의 전기화학적 검출을 수행하였다. 막대 타입의 글래시 카본 전극에 SWCNT를 캐스팅 한 후 트롬빈 결합 앱타머(TBA)를 결합시킨 후 목표 단백질인 트롬빈의 존재 시 SWCNT에 결합한 트롬빈 결합 앱타머가 용액중에 존재하는 트롬빈과의 결합을 위해 SWCNT로부터 떨어져나가 감소하여 발생하는 Ru(bpy)3 2+ 산화 전류를 측정함으로서 트롬빈의 양을 정량 할 수 있음이 확인되었다. 본 연구에서는 10 nM의 트롬빈을 검출하였다.
또한 극미세전극을 이용하여 마이크로미터 단위의 영역에서 일어나는 전기화학적 현상을 측정하는 전기화학적 주사현미경을 이용한 트롬빈의 검출에 대한 연구도 진행되었다. 트롬빈과 선택적 결합이 가능한 각기 다른 염기 서열을 갖는 트롬빈 결합 앱타머를 이용하여 샌드위치 방식을 이용하여 트롬빈 검출을 진행하였다. 금 전극에 15개의 염기 서열을 갖는 트롬빈 결합 앱타머를 자가조립단분자(SAM) 방식을 이용하여 고정한 후 목표 단백질인 트롬빈이 먼저 15개 염기서열의 트롬빈 결합 앱타머에 결합하면 이 후 29개의 염기서열을 갖는 다른 트롬빈 결합 앱타머가 15개 염기서열의 트롬빈 결합 앱타머가 결합한 부위와 다른 결합자리에 결합하며 끝에 고정된 클루코스 산화효소에 의해 클루코스가 산화되어 생성되는 과산화수소를 전기화학적 주사현미경의 극미세 팁을 이용하여 산화전류를 측정함으로서 트롬빈의 전기화학적 측정을 수행 하여 10 nM의 검출한계를 얻어내었다.
또한 본 학위논문에서는 DNA의 유사체인 PNA를 이용하여 어레이 타입의 전기화학적 센서에 관한 연구를 진행하였다. PNA는 DNA의 음전하를 띠는 인산 골격을 중성의 아미노에틸 골격으로 치환하여 DNA에 비해 안정성을 높은 물질로 DNA의 염기와 서로 상보적 결합이 가능하다. 본 연구에서는 말단에 시스테인이 치환된 PNA를 자가조립단분자 방법을 통해 금 전극에 작은 스팟 형태로 고정한 후 PNA의 염기 서열과 서로 상보적인 서열을 갖는 목표 DNA가 존재 시 결합을 한 부분에 전기화학적 주사 현미경의 극미세 전극을 스캔하며 음전하를 띠는 목표 DNA에 의해 확산이 방해되어 감소되는 [Fe(CN)6] 3-/4-의 환원 전류의 변화를 측정함으로서 10 nM의 검출한계를 갖는 DNA의 양을 검출하였다.
