Ex vivo-expanded, allogeneic natural killer (NK) cells can be used for the treatment of various types of cancer. In allogeneic NK cell therapy, NK cells from healthy donors must be expanded in order to obtain a sufficient number of highly purified, activated NK cells. In the present study, we established a simplified and efficient method for the large-scale expansion and activation of NK cells from healthy donors under good manufacturing practice (GMP) conditions. After a single step of magnetic depletion of CD3+ T cells, the depleted peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were stimulated and expanded with irradiated autologous PBMCs in the presence of OKT3 and IL-2 for 14 days, resulting in a highly pure population of CD3-CD16+CD56+ NK cells which is desired for allogeneic purpose.
Compared with freshly isolated NK cells, these expanded NK cells exhibited activated phenotypes, and showed robust cytokine production and potent cytolytic activity against various cancer cell lines in vitro. In vivo anti-tumor efficacy of expanded NK cells was also verified by various xenograft mouse models. Furthermore, expanded NK cells expressing high levels of CD16 (FcγRIII) efficiently induced tumor regression mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) with extremely low dose of rituximab in Raji human B-cell lymphoma model
Of note, cytolytic activity of expanded NK cells was focused on tumor targets while sparing normal cells in coculture assays, supporting the feasibility of clinical application of expanded NK cells for allogeneic NK cell therapy. In fact, no significant side effects have been noted in the phase I clinical study using expanded allogeneic NK cells.
Genetic and phenotypic analyses of donor-versus-recipient incompatibility in vitro and in vivo suggested that the percentages of KIR-mismatched NK cells correlated with both in vitro anti-tumor cytotoxicity and clinical outcomes. Allogeneic NK cell therapy from KIR A/B donors seems to improve disease outcomes compared to NK cell therapy form KIR A/A donors. The level of surface expression of activating or inhibitory molecules on both donor NK cells and tumor targets was also shown to have impacts on anti-tumor efficacy of expanded NK cells.
In conclusion, allogeneic NK cells were efficiently expanded in a GMP-compliant facility and demonstrated potent anti-tumor activity both in vitro and in vivo without toxicity. Factors determining donor-versus-recipient NK cell alloreactivity in the present study can be applied to find optimal donor conditions to improve clinical outcomes.
체외에서 배양된 동종 자연살해 (NK) 세포를 다양한 암종의 항암치료에 사용할 수 있는데, 이를 위해서는 고순도의 활성화된 NK 세포를 치료에 충분한 세포 수만큼 배양하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 GMP (good manufacturing practice, 우수의약품의 제조o관리 기준)에 적합한 방법을 통해 건강한 공여자로부터 얻은 세포로부터 NK 세포를 대량으로 배양하고 활성화시키는 방법을 확립하였다. CD3+ T 세포를 제거한 말초혈액단핵세포 (PBMC)를 IL-2, OKT3 및 불활화시킨 PBMC와 함께 14일간 배양하여 동종치료목적으로 사용 가능한 고순도의 CD3-CD16+CD56+ NK 세포를 얻을 수 있었다.
혈중에 존재하는 NK 세포와 비교하여, 본 연구에서 배양된 NK 세포는 더욱 활성화된 표현형을 나타내며 다양한 종양 세포주에 반응하여 강력한 사이토카인 분비 및 세포살해능을 보였다. 또한, 다양한 마우스 종양 모델에서도 배양한 NK 세포를 투약함으로써 효과적으로 항종양 효과가 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 게다가, 배양된 NK 세포는 CD16 (FcγRIII)를 효과적으로 발현함으로써 극미량의 rituximab으로도 효과적으로 항체의존성 세포매개성 세포독성 (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 유도한다는 것을 Raji B 세포 림프종 모델에서 확인하였다.
주목할만한 것은, 배양된 NK 세포가 정상 세포는 그대로 두고 종양에 대해서만 선택적으로 세포살해능을 보인다는 것을 확인함으로써 동종 NK 세포를 임상에 적용 할 수 있는 가능성을 확인하였다는 것이다. 실제로 본 연구에서 개발된 동종 NK 세포를 임상 1상에 적용한 결과 부작용이 없음이 보고되었다.
환자와 공여자 세포의 유전자 및 표현형 분석 연구를 통해, 환자의 MHC와 불일치하는 KIR를 발현하는 NK 세포의 함량 정도가 NK 세포의 세포살해능 및 실제 임상결과와 상관관계가 있다는 분석결과를 제시하였다. 또한 동종 NK 세포 치료에 있어서, KIR 유전자 A/B를 가진 공여자의 경우 A/A를 가지는 공여자보다 임상결과가 향상되는 것을 관찰하였다. NK 세포와 종양의 표면에 발현하는 활성 및 억제에 관련된 수용체 및 리간드의 발현 또한 NK 세포의 세포살해능 및 임상결과에 영향을 미친다는 것을 확인하였다.
결론적으로, 본 연구를 통하여 GMP 기준에 적합하게 NK 세포를 배양하는 방법을 확립하였고, 그렇게 배양된 NK 세포는 in vitro와 in vivo에서 부작용 없이 강력한 항종양 효과를 나타냄을 확인하였다. 또한, 본 연구에서 밝힌 환자와 공여자간 NK 세포의 동종 면역반응을 결정하는 요소는 실제 임상에서 치료결과를 향상시키기 위하여 적합한 공여자 조건을 찾는데 적용될 수 있을 것이다.
