Tuberculosis (TB) is a chronic infectious disease caused by bacteria Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). It is assumed that about one-third of the world’s population, approximately more than 2 billion population, is infected with M. tuberculosis. The most effective strategy to control TB epidemic is to prevent the spread of M. tuberculosis by vaccination. However, The only available vaccine against TB, BCG does not demonstrate consistent efficacy to adult, pulmonary TB. Thus, there is a need to develop new, efficacious vaccines against TB.
In the present study, rpfB-encoding plasmid DNA (pcDNA3.1+/RpfB) was developed to evaluate possibility of developing TB vaccine using the RpfB as a candidate antigen. And recombinant RpfB protein was also produced to compare with DNA vaccine. To evaluate the immunogenicity, humoral immune response and cell-mediated immune response were assessed. Vaccine-induced humoral immune response, serum α-RpfB immunoglobulin was significantly increased in RpfB protein vaccine group. On the contrary, cell-mediated immune response, RpfB-specific T cell response was robust in RpfB DNA vaccine group. RpfB DNA vaccine induced strong IFN-γ producing response in ELISpot assay and polyfunctional CD8+ (IFN-γ+TNF-α+CD107a+) and CD4+ (IFN-γ+TNF-α+ or IFN-γ+TNF-α+CD107a+) T cells in multi-parameter flowcytometry. Especially, RpfB-specific CD8+ T cell response detected in RpfB DNA vaccine group only. DNA vaccine-induced CD4+ T cells were less polyfunctional and the frequency of responding cells were small compared to RpfB-specific CD8+ T cells, although it was much compared to protein vaccine-induced CD4+ T cells.
To evaluate the protective efficacy of RpfB vaccines, bacterial reduction was assessed by colony forming unit (CFU) of M. tuberculosis murine infection model. The evaluation of the protective efficacy carried out compared with bacterial reduction in BCG vaccine group. RpfB DNA vaccine induced bacterial reduction, however the protective efficacy was not significant in murine infection model. The efficacy of DNA vaccine was reduced after mycobacterial infection. DNA vaccine-induced RpfB-specific polyfunctional CD8+ T cells were maintained at the early time in mycobacterial infection. However, the frequency of RpfB-specific CD8+ T cell was decreased as well as their functionality during the course of M. tuberculosis infection. It seems that the reduction of polyfunctional CD8+ T cells might be the cause of modest and diminishing protection of DNA vaccination.
In conclusion, RpfB DNA vaccine could induce robust cell-mediated immune response. Especially, polyfunctional CD8+ T cells were induced by DNA vaccination. RpfB DNA vaccine induced bacterial reduction in early time of mycobacterial infection although it was not significant and sufficient. In view of these results, RpfB has potential to candidate antigen for DNA vaccine against tuberculosis.
결핵은 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)에 의한 만성 감염질환으로, 전 세계 인구 의 약 3 분의 1, 약 20 억 이상의 인구가 결핵균 에 감염되어 있다고 추정되고 있는 실정이다. 결핵의 확산을 제어하기 위한 가장 효과적인 방법은 백신을 통해 결핵의 감염을 방지하는 것이지만, 현재 유일하게 사용 가능한 결핵백신인 BCG는 가장 흔하고 전염력이 강한 폐결핵에 대한 효과가 없는 것으로 보고 되고 있어, 새로운 결핵백신의 필요성이 제기되고 있다. 결핵에 대한 면역반응 중에서는 세포매개 면역반응이 가장 중요하며, 백신의 종류 중에서는 DNA 백신이 CD4+와 CD8+ T 세포반응을 모두 유도할 수 있다고 알려져 있다. 이에 본 연구에서는 결핵균의 rpfB가 클로닝 된 plasmid DNA (pcDNA3.1+/RpfB)를 사용하여 결핵백신의 후보 항원으로서 Rpf를 평가하기 위한 연구를 진행하였으며, DNA 백신의 비교군으로 RpfB 단백 아단위(subunit) 백신을 사용하였다.
백신의 면역원성을 검증하기 위해, 혈청 α-RpfB 면역글로불린을 통해 백신으로 유도된 체액성 면역을 확인하고 IFN-γ ELISpot과 multi-parameter flowcytometry를 통해 RpfB-특이 T 세포 반응으로 세포매개면역반응을 확인하였다. 백신에 의해 유도된 체액성 면역반응은 RpfB DNA 백신에 비해 RpfB 단백 백신 접종에서 더 크게 나타났다. 반대로, RpfB-특이 T 세포 반응은 DNA 백신군에서 더 우월하였는데, RpfB 단백 백신 접종으로 유도된 T 세포 반응은 ELISpot에서만 약하게 검출되었다. RpfB DNA 백신으로 유도된 강한 IFN-γ 반응을 ELISpot을 통해 확인할 수 있었고, multi-parameter flowcytometry를 통해 다기능 CD8+ (IFN-γ+TNF-α+CD107a+) 및 CD4+ (IFN-γ+TNF-α+ 또는 IFN-γ+TNF-α+CD107a+) T 세포를 확인할 수 있었다. 특히, RpfB-특이 CD8+ T 세포 반응은 RpfB DNA 백신에서만 확인 되었으며, DNA 백신에 의해 유도 된 CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포에 비해 기능성이 떨어지지만, RpfB 단백 백신에 의해 유도 된 CD4+ T 세포보다는 더 강한 반응을 보여주었다.
결핵균 감염에 대한 RpfB 백신의 보호 능력은 백신 접종 이후 결핵균을 감염 시킨 생쥐의 폐와 비장에서 결핵균의 colony forming unit (CFU) 을 통해 평가하였다. RpfB 백신의 보호 능력 검증은 BCG 백신과 비교를 통해 이루어졌는데, RpfB DNA 백신은 Mock DNA 백신에 비해 결핵균의 감소를 보여주었으나, 통계적인 유의성은 없었고, BCG 백신과 동등하거나 혹은 더 뛰어난 효과를 보여주지 못하였다. 결핵 감염 후, RpfB-특이 CD4+ T 세포 반응은 감염 후에도 크게 증가되지 않았고, 결핵의 다른 항원(ESAT-6)에 대한 CD4+ T 세포와 비교해 볼 때 매우 약한 반응을 보여주었다. CD8+ T 세포 반응은 감염 전과 마찬가지로 DNA 백신에서만 강하게 나타났고, 다기능 CD8+ (IFN-γ+TNF-α+CD107a+) T 세포였지만, 시간이 경과함에 따라 반응의 크기와 기능성 모두 감소하였다. 지속적이지 못한 다기능 CD8+ T 세포가 DNA 백신의 효과에 영향을 주어서 의미 있는 수준까지 결핵균을 감소시키지 못한 것으로 생각된다.
결론적으로, 본 연구에서는RpfB DNA 백신이 강력한 다기능 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있음을 보여주었고, 결핵 감염에 대해 의미 있는 효과를 나타내지는 못했지만, RpfB DNA 단독으로도 결핵균의 감소를 일으킬 수 있음을 확인하여, RpfB를 후보항원으로 하는 DNA 백신 개발이 가능성을 가지고 있음을 보였다.
