Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most commonly used mammalian hosts for the produc-tion of therapeutic proteins. One of the strategies for increasing overall product yield CHO cell culture is productivity enhancer like sodium butyrate (NaBu). Though a number of reports have demonstrated that the addition of NaBu to culture media enhances the qp in CHO cells, the addition of NaBu causes apoptotic cell death, and consequently, shortens culture longevity. Therefore, in batch culture of CHO cells, the addition of NaBu often resulted in only marginal increase in recombinant protein production. In the first, I demonstrated that IGF-1(major growth factor in serum-free medium for CHO cells) withdrawal in combination with NaBu addition significantly increased specific productivity of monoclonal antibody (Mab) and markedly retarded cell death, leading to extended culture longevity. For instance, at 3 mM NaBu, cell viability fell below 80% after day 4 in IGF-1-containing medium, but it remained over 80% after day18 in IGF-1-deficient medium. Due to the enhanced qMab and the extended culture longevity, approximately 2-fold increase in total antibody production was achieved in pseudo-perfusion culture with 1 mM NaBu in IGF-1-deficient medium, compared to the culture in IGF-1-containing medium. The change in the expression of cellular proteins, c-Myc and Bcl-2 was investigated. Both the withdrawal of IGF-1 and the addition of NaBu decreased the expression of c-Myc. However, the decrease of c-Myc expression itself is not likely to be the critical factor for the retardation of cell death. To better understand the retarded cell death in IGF-1-deficient medium with NaBu, further investiga-tions would be highly needed. The expression of endogenous Bcl-2 was enhanced by the addition of NaBu in a dose-dependent manner while it was not affected by the withdrawal of IGF-1. In addition, both the with-drawal of IGF-1 and the addition of NaBu reduced metabolic rates, qGlc, qLac and YLac/Glc, and increased py-ruvate dehydrogenase (PDH) activity while not affecting PDH expression, suggesting that they may reduce the glycolytic rates but enhance the conversion rate of pyruvate to TCA intermediates. Taken together, the withdrawal of IGF-1 in combination with the addition of NaBu can be considered as a relevant strategy for alleviating NaBu-induced cell apoptosis and obtaining a large amount of recombinant antibody since it can be easily implemented as well as enhance qAb and extend culture longevity.
In second, Sodium butyrate (NaBu) is known to increase specific productivity of recombinant CHO (rCHO) cells. To understand the effects of NaBu on the product quality, rCHO cells producing monoclonal antibody (Mab) (CS13-1.0) were cultivated at various concentrations of NaBu (0 to 4 mM). NaBu incerased Mab assembly. In the absence of NaBu, the proprtions of intact Mab (2H2L) and heavy chain dimer (2H) were 81% and 15%. At 1 mM NaBu, the portion of 2H2L increased to 93%, whereas the proportion of 2H decreased to 2%. No further increase in the portion of 2H2L2 was obtained at higher NaBu concentration. NaBu also affected charge heterogeneity of Mab, which may affect the efficacy of Mab. Basic chrage variants of Mabs increased with increasing concentrations of NaBu. In contarst, NaBu did not affect galac-tosylation of Mab significantly. Taken together, the data obtained here show that NaBu used in rCHO cell cultures for improved Mab production affects the quality of Mab such as charge heterogeneity.
In the third chapter, effect of ammonia on CHO cell growth and galactosylation of Mab was investi-gated using shaking flasks with media containing 0 - 15 mM NH4Cl. The elevated ammonia inhibited cell growth and negatively affected the galactosylation of rIgG. At 15 mM NH4Cl, the proportions of G1F (mo-nogalactosylated glycan with fucose) and G2F (digalactosylated glycan with fucose) were 23.9% and 6.3% lower than those at 0 mM NH4Cl, respectively. To reduce ammonia formation by cells, glutamate was exam-ined as a substitute for glutamine. The use of glutamate reduced the accumulation of ammonia and en-hanced the production of Mab while depressing cell growth. At 6 mM glutamate, ammonia level did not ex-ceed 2 mM, which is only one-third of that at 6 mM glutamine. Also, 1.7-fold increases in the titer of Mab and specific Mab productivity, qMab, was achieved at 6 mM glutamate. The galactosylation of Mab was fa-vorable at 6 mM glutamate. The proportion of galactosylated glycans, G1F and G2F, at 6 mM glutamate was 59.8%, but it was 50.4% at 6 mM glutamine. The use of glutamate also increased complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity, one of the effector functions of Mab. Taken together, the results obtained in this study suggest that substitution of glutamine by glutamate can be considered relevant for the production of Mab.
In conclusion, the withdrawal of IGF-1 in combination with the addition of NaBu can be considered as a relevant strategy for alleviating NaBu-induced cell apoptosis and obtaining a large amount of recombi-nant antibody since it can be easily implemented as well as enhance qAb and extend culture longevity. How-ever, dose of NaBu should be well-tuned in terms of antibody heterogeneity, because addition of NaBu af-fected quality of Mab significantly. In order to improve galactosylation of Mab glycan, ammonia that is ma-jor byproduct in CHO cell culture, have to be controlled to low level. So, substitution of glutamine by gluta-mate can be considered useful for the production of Mab.
Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 치료용 단백질 생산을 위해 대표적으로 사용되는 숙주세포이고 CHO 세포로부터 생산되는 치료용 단일클론 항체는 다양한 질병의 치료를 위한 매우 귀중한 의약품으로 증명되어 오고 있다. CHO 세포 배양에서 단일클론 항체를 생산하는데 있어 중요한 고려사항은 생산성과 품질이고 이 학위논문은 생산성과 품질을 증가시키기 위한 전략에 대하여 연구한 결과이다.
먼저 CHO 세포 배양에서 생산성을 증가시키는 전략 가운데 한가지가 뷰티르산 염 같은 생산성 증가인자이다. 많은 연구들로부터 뷰티르산 염을 세포배양 배지에 첨가하는 것이 생산성을 증가시켜준다고 보고하고 있지만 뷰티르산의 첨가는 apoptotic 세포사를 유발하여 배양기간을 단축시키게 된다. 따라서 CHO 세포의 배양에서 뷰티르산 염을 첨가하는 것이 종종 단백질 생산에서 최소한의 증가만을 얻는 경우가 많다. 이를 해결하기 위하여 뷰티르산 염을 첨가함과 동시에 배지의 IGF-1 (CHO 세포 배양을 위한 무혈청배지에서의 주요 성장인자)을 첨가하지 않는 것이 단일클론 항체의 생산성을 매우 높은 수준으로 증가시키고 세포사를 지연시켜 배양기간을 연장시킬 수 있음을 보여주었다. IGF-1을 포함한 배지에 3 mM의 뷰티르산 염을 첨가하면 4일 이후에 세포의 생존율이 80퍼센트 이하를 보여주었지만 IGF-1이 없는 배지에 3 mM의 뷰티르산 염을 첨가하면 18일 이후에도 세포 생존율이 80 퍼센트 이상을 나타내었다. Pseudo-perfusion 배양 방식으로 1mM 의 뷰티르산 염을 첨가할 때 IGF-1을 배제한 조건에서 IGF-1을 첨가한 조건에 비하여 항체 생산성의 증가와 배양기간 연장으로 인하여 2배의 항체 총 생산량을 확보할 수 있었다. 세포 내부의 단백질 발현의 변화를 확인하기 위하여 c-Myc 과 Bcl-2의 발현 변화를 확인하였다. IGF-1을 배제하거나 뷰티르산 염을 첨가한 조건 모두에서 c-Myc 발현이 감소하였다. 그러나 c-Myc 발현의 감소 자체가 세포사를 지연시키는 주요인자가 되지는 않을 것으로 판단된다. 뷰티르산 염을 첨가하고 IGF-1을 배제한 배지에서 세포사가 지연되는 이유를 알기 위해서는 더 많은 연구가 필요할 것이다. 뷰티르산 염에 의한 세포사멸을 줄이기 위하여 IGF-1을 배지에서 제거하는 것은 간단히 적용할 수 있기 때문에 실제로 적용될 수 있다는 의미가 있다.
다음은 CHO 세포 배양에서 생산성을 증가시키는 것으로 알려진 뷰티르산 염을 첨가하는 것이 단일클론 항체의 품질에 어떤 영향을 주는지에 대한 연구이다. 이를 위하여 단일클론 항체를 생산하는 세포주 (CS13-1.0)을 다양한 농도(0 mM ~ 4 mM)의 뷰티르산 염을 첨가한 배지에서 배양하였다. 뷰티르산 염은 단일클론 항체의 Assembly를 증가시켰다. 뷰티르산 염이 없는 배지에서 완전히 조립된 형태의 단일클론 항체(2H2L)는 81%에 불과하였고 대신 두개의 중쇄만 결합된 2H가 15%로 확인되었다. 1mM 의 뷰티르산 염을 첨가하면 2H2L이 93%까지 증가하였고, 대신 2H는 2%로 감소하였다. 더 높은 농도의 뷰티르산 염을 첨가하더라도 2H2L이 더 늘어나지는 않았다. 또한 뷰티르산 염은 단일클론 항체의 전하 불균질성에 영향을 주었는데 이것은 항체의 약효에 영향을 주기 때문에 의미가 있다. 뷰티르산 염의 농도가 증가할수록 단일클론 항체의 염기성 전하 변이체가 증가하였다. 반면에 뷰티르산 염은 단일클론 항체의 Galactosylation에는 큰 영향을 주지 않았다. 결국 재조합 CHO 세포배양에서 생산성을 증가시키기 위하여 사용되는 뷰티르산 염은 단일클론 항체의 전하 불균질성같은 품질에 영향을 주는 것을 확인하였다.
세번째로 CHO 세포배양에서 암모니아가 세포 성장과 단일클론 항체의 Galactosylation에 미치는 영향을 조사하였다. 교반 플라스크를 사용하였고 암모니아 농도를 0 ~ 15 mM 첨가하였다. 암모니아 농도가 증가할수록 세포 성장과 재조합 항체의 Galactosylation이 저해되었다. 15 mM의 암모니아에서 of G1F (monogalactosylated glycan with fu-cose)와 G2F (digalactosylated glycan with fucose) 의 비율이 각각 23.9 % 와 6.3 %로 확인되었고 이는 0 mM 암노니아 조건보다 낮은 수준이었다. 세포로부터 암모니아 발생을 줄이기 위하여 글루타민의 대체 성분으로써 글루탐산 염의 사용을 평가하였다. 글루탐산 염의 사용은 암모니아의 축적을 감소시켜주었고 항체의 생산을 증가시켰다. 반면에 세포의 성장속도는 감소하였다. 6 mM의 글루탐산 염을 첨가한 경우 암모니아는 2 mM을 초과하지 않았는데 이는 6 mM 의 글루타민을 첨가한 경우 발생한 암모니아의 3분의 1에 불과한 수준이었다. 또한 6 mM의 글루탐산 염을 첨가할 때 단일클론 항체의 생산량 및 생산성이 1.7배 증가하였다. 항체의 Galactosylation에 있어서 6 mM 글루타민을 사용할 때에 비하여 6 mM 글루탐산 염을 사용하는 것이 유리하였다. 6 mM 글루탐산 염에서 G1F와 G2F는 59.8 % 로 확인되었는데 6 mM 글루타민에서는 50.4 % 로 나타났다. 또한 글루탐산염을 사용하는 것은 단일클론 항체의 작용기능의 하나인 complement-dependent cytotoxicity (CDC)를 증가시켰다. 결국 글루타민 대신 글루탐산 염을 사용하는 것이 항체의 생산성과 품질 측면에서 적합하다 할 수 있다.
결론적으로 뷰티르산 염을 첨가함과 동시에 IGF-1을 첨가하지 않는 것이 뷰티르산 염에 의한 세포사멸을 줄이고 재조합 항체의 생산을 증가시키는데 적절한 방법일 수 있음을 보였다. 이는 생산성 증가와 더불어 배양기간 연장으로 비롯된다. 그러나 뷰티르산 염의 첨가는 단일클론 항체의 전하 불균질성 측면에서 잘 조절되어야 한다. 왜냐하면 뷰티르산 염의 첨가는 항체의 2H2L을 증가시키지만 염기성 전하 변이체를 증가시켜 항체의 약효에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 항체의 당쇄에서 Galactosylation을 증가시키기 위하여 CHO 세포배양에서 발생하는 주된 노폐물인 암모니아를 낮은 수준으로 조절하여야 한다. 이를 위하여 글루타민 대신 글루탐산 염의 사용은 항체의 생산성과 당쇄의 갈당화에 유용한 전략이 될 수 있다.
