Since plant growth is dependent on ambient environmental conditions, seeds need to monitor the environ-ment in order to determine the proper timing of germination. Among these conditions, light and temperature have been shown to play critical roles in regulating seed germination. In Arabidopsis, light promotes seed germination, whereas high temperature inhibits seed germination. Previous studies have shown that these signals regulate seed germination via regulation of endogenous plant hormones such as gibberellic acid (GA) and abscisic acid (ABA), which have positive and negative roles in seed germination, respectively.
Among the photoreceptors, phytochromes mediate light signaling to promote seed germination. The key negative regulator of light-dependent seed germination is PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR1 (PIF1, also known as PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR3-LIKE5 [PIL5]), a basic helix-loop-helix transcription factor. Among the direct targets of PIL5, we previously reported that SOMNUS (SOM), a seed specific tandem CCCH zinc finger protein, is a novel negative regulator of light-dependent seed germination. In dark, SOM inhibits seed germination via activating ABA biosynthesis and inhibiting GA biosynthesis. Light promotes seed germination via repressing the PIL5-mediated SOM expression. To date, the molecular function of SOM is unknown.
We first studied about the molecular characteristics of SOM. SOM protein is consisted by a single exon which contains three tandem zinc finger motifs in the middle region. We found that SOM protein forms a homodimer through its C-terminal region, which contains a putative nuclear export signal (NES) at the end of exon. Consistent with this, protoplast assay showed that SOM localized predominantly to cytoplasm. Muta-genesis of zinc finger motif or exchange of NES to nuclear localization signal (NLS) showed that CCCH zinc finger motif and/or cytoplasmic localization of SOM are important to inhibit seed germination under high temperature. Tandem CCCH zinc finger proteins have reported that they can bind to RNA, suggesting that SOM may be a RNA-binding protein. Taken together, our results indicate that SOM forms a homodimer and inhibits seed germination possibly via regulation of target mRNA stability.
Expression analysis indicated that SOM expression is also regulated by ABA INSENSITIVE3 (ABI3), a positive component of ABA signaling. Since ABI3 was reported to inhibit seed germination under high tem-perature, we examined if high temperature inhibits seed germination through SOM. Our results revealed that high temperature activates the SOM expression. Consistent with this finding, som mutants germinated more frequently than the wild-type at high temperature. Both ABA and GA biosynthesis were required for the in-duction of SOM mRNA at high temperature. Among signaling components, ABI3, ABI5, and DELLAs posi-tively regulated the SOM expression. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays further indicated that ABI3, ABI5, and DELLAs all target the SOM promoter. At the protein level, ABI3, ABI5, and DELLAs all interacted with each other, suggesting that they form a complex on the SOM promoter to activate the SOM expression at high temperature. We further found that a subset of high temperature-inducible genes required targeting of ABI3, ABI5, and DELLAs for their expression. Taken together, our results indicate that ABI3, ABI5, and DELLAs mediate ABA and GA signaling to activate the expression of SOM and other high tem-perature-inducible genes.
Keywords: Seed germination, High temperature, GA, ABA, SOM
식물의 생장은 주위 환경에 의존적이다. 종자는 발아에 적절한 시기를 정하기 위해서, 주위의 환경을 감지하는 메커니즘이 필요하다. 여러 환경 요인들 중, 빛과 온도는 종자 발아를 조절하는 주된 요인들이다. 빛은 애기장대의 발아를 촉진하는 반면, 고온은 발아를 억제한다. 이들은 식물 호르몬 중, 지베렐린 (발아 촉진)과 앱시스산 (발아 억제)의 조절을 통해 발아에 영향을 준다고 알려져 있다.
빛은 파이토크롬이라는 광수용체를 통해 발아를 촉진한다. 파이토크롬의 하위 인자 중, PIL5는 발아를 억제하는 핵심 인자이다. 우리는 기존 연구를 통해, SOMNUS (SOM)라는 단백질이 PIL5의 하위에서 빛에 의한 발아를 억제한다고 밝혔다. 빛이 없을 때, SOM은 앱시스산의 생합성을 촉진하고, 지베렐린 생합성을 억제한다. 하지만, 아직까지 SOM이 호르몬 합성을 조절하는 분자적 메커니즘은 밝혀지지 않았다.
이 메커니즘을 밝히기 위해, 먼저 SOM 단백질의 기본적인 특징에 대해 연구하였다. SOM 단백질은 하나의 엑손으로 이루어져 있으며, 엑손 중간에 일련의 CCCH zinc finger 도메인을 가지고 있다. 일련의 실험을 통해, SOM 단백질은 카르복실기 말단부위를 통해 동형이량체를 이루며, 원형질체 내에서 세포질에 존재한다는 것을 발견하였다. SOM의 zinc finger 도메인을 돌연변이 시키거나 SOM 단백질이 핵 속에만 존재하도록 변형시키면, SOM에 의한 발아 억제가 약화되는 것을 발견하였다. 즉, SOM 단백질은 주로 세포질에서 기능을 수행하며, zinc finger 도메인이 SOM 기능에 중요하다는 것을 알 수 있었다. 기존 논문들에서, 일련의 CCCH zinc finger 도메인을 갖는 단백질들은 특정 RNA에 결합하여 기능을 수행한다고 알려져 있다. 이번 연구를 종합해보면, SOM 단백질은 동형이량체를 이루며, 세포질에서 하위 유전자의 RNA에 결합하여 RNA의 안정성을 조절할 것으로 추측할 수 있다. 추가적인 실험을 통해, 보다 더 정확한 메커니즘을 규명할 수 있을 것으로 보인다.
한편, 기존 연구를 통해, SOM 유전자 발현은 앱시스산 신호전달을 촉진하는ABI3단백질에 의해서도 조절을 받는다고 알려져 있다. 흥미롭게도, ABI3는 고온에 의한 발아 억제에 관여한다고 알려져 있기 때문에, 우리는 SOM도 고온에 의한 발아 억제에 관여하는지 연구하였다. 우리는 일련의 실험을 통해, 고온에서 SOM 유전자 발현이 증가하며, som 돌연변이체는 고온에서도 발아를 잘 한다는 것을 발견하였다. 또한, 고온에서 SOM 유전자 발현은 앱시스산과 지베렐린 신호전달이 필요하며, 앱시스산 신호전달을 촉진하는 ABI3와 ABI5, 그리고 지베렐린 신호전달을 억제하는 DELLA 단백질들이 SOM 유전자의 프로모터 부위에 결합하여 발현을 촉진한다는 것을 발견하였다. 즉, 고온에서는 앱시스산의 합성을 증가시키고, 지베렐린의 합성을 감소시켜서, ABI3와 ABI5, 그리고 DELLA을 통해 SOM의 발현을 증가시킨다. 이렇게 증가된 SOM은 앱시스산의 합성을 더욱 증가시키고, 지베렐린의 합성을 더욱 감소시켜서, 종자 발아를 계속 억제한다. 이번 연구를 종합해보면, SOM은 빛에 의한 발아뿐만 아니라, 고온에 의한 발아 조절에도 관여함으로써, 다양한 환경 신호를 전달하는 중요한 유전자라는 것을 알 수 있다.
핵심어 : 종자 발아, 고온, 지베렐린, 앱시스산, SOM
