This thesis presents an integrated microfluidic platform for interactive single-cell screening of lipid-rich microalgae using droplet microfluidics. To achieve the efficient production of biofuels from algal biomass with economically viable process, selection and growing of highly productive lipid-rich algal strains should be preceded. Especially, the heterogeneity in the lipid accumulation among the individual cells in the same species should be monitored and investigated in a single cell level. Extraordinary advances in droplet microfluidics systems have been made on the basis of the development of droplet manipulation technology with encapsulation method in a single cell level. Monodispersed hydrogel microcapsules can be considered one of the microreactors which encapsulate a cell of interest by utilizing the droplet manipulation technology in a high-throughput manner, and are then transported downstream to allow the quantitative monitor the lipid accumulation of each alga. Also, microcapsules ensure the algal cell viability and capability of other analysis after determination. To guarantee the enhanced single-cell encapsulation efficiency, a new fluid introduction scheme with reduced particle adsorption was first proposed. This idea is based on a novel microparticle injection technique with lateral interconnection, which prevents particle loss, assisted by sample injection along the direction of fluid flow. Biological sample fluids, including fluorescent microparticles, and mammalian (U937) and green algae cells (Chlorella vulgaris), were injected directly via a through-hole drilled in the lateral direction, resulting in a significant reduction in microparticle attachment. It was confirmed that the proposed method accomplished a 100% enhancement of single-cell encapsulation compared to a Poisson distribution. At the high concentration (5×107 cells/mL) of C. vulgaris, the fraction of droplets containing single cells increased gradually from 28.67% to 40.00%. At a lower concentration (1×107 cells/mL), there was an increase in the percentage of droplets including single cells from 15.33% to 35.33%.
Secondly, a facile and robust microfluidic platform enabling uniform interval control of flowing droplets for the precise temporal synchronization and pairing of picoliter droplets with a reagent was presented. The microbridge structures interconnecting the droplet-carrying channel and the flow control channel were associated to derive a fluidic pressure drop between two microchannels via the microbridge structures, reordering flowing droplets with a defined uniform interval. The droplet intervals were flexibly and precisely adjusted through the change of the control oil flow rate. With this mechanism of droplet spacing, the gelation of the alginate droplets as well as control of the droplet interval was simultaneously achieved by additional control oil flow including calcified oleic acid. In addition, controlled synchronization and pairing of two distinct droplets were demonstrated by parallel linking identical microfluidic modules with distinct sample inlet. As a new microfluidic interactive sorting technologies, a hybrid optoelectrofluidic platform which allows on-demand release of target microparticles from specific microwell with simple optical configuration was also suggested. The combination of an optoelectrofluidic device and the photopolymerizable hydrogel microwell arrays enables interactive and programmable releasing using optically induced virtual electrodes. The microparticles can be passively loaded to the separate microwells via sedimentation and the trapped particle was individually repelled and positioned close to the ground electrode by optically-induced negative dielectrophoretic forces when a dynamic image pattern was projected into an area of the specific microwell under the application of AC signal with 20 V bias at 100 kHz. I also demonstrated the selective and parallel release of distinct particles from each microwell.
Finally, all the above-mentioned technologies, including encapsulation, manipulation, and interactive selection, were contributed to develop a new biofuel screening platform based on the droplet-microfluidics, Three species of green microalgae, (Chlorella vulgaris, Chlamydomonas sp. and Botryococcus braunii) were encapsulated in the monodispersed hydrogel microcapsule, and the quantitative comparison of their lipid content of individual cells in situ by tagging with BODIPY dye was performed. Stochastic heterogeneity in the lipid content was verified under a highly viable physiological condition, implying that other analyses were possible after the determination of lipid content. Furthermore, the designed microwell arrays enabled us to distinguish the BODIPY fluorescence response of a single live alga within the microcapsules. The newly proposed microcapsule-based interactive platform for screening of lipid-rich microalgae in this dissertation is now technically ready-to-use for exploiting the alternative energy and will provide versatile tools for environmental engineering research.
광합성을 통해 자라는 미세조류는 바이오디젤 작물 중에서 생산성이 가장 우수하고 지속적인 햇빛과 이산화탄소를 제공하면 대량배양이 가능하기 때문에 미래의 대체 에너지 자원으로 각광받고 있다. 미세조류가 지질을 축적하는 방법은 광합성 등의 여러 가지가 있지만 그 중에서도 영양분의 공급을 제하는 등의 외부 환경적인 스트레스를 가하게 되면 자가적으로 지질 함량을 폭발적으로 늘릴 수 있다. 이에 따라 수천 종에 달하는 조류 종에 대한 연구가 현재 진행 중이며, 종 간에 축적할 수 있는 지질 함량, 외부 스트레스에 의해 생기는 지질 함량의 차이 등 여러 가지 요인에 대한 학문적 고찰이 필요한 상황이다. 특히, 미세조류로부터 지질을 추출하기 위해서는 고비용을 수반하는 과정이 필요하기 때문에 효율적인 바이오 디젤 생산을 위해서는 지질 함량이 높은 종의 선별이 필수적이나, 현재 상황에서는 배치 타입에서의 지질 함량 정량화만 가능하다는 기술적인 한계가 존재한다.
본 연구에서는 단일 세포를 피코리터(10-12 리터) 부피의 미세액적에 캡슐화하여 조작할 수 있는 미세액적 기반의 단일세포 스크리닝 기술을 도입하였다. 미세액적은 미세채널 내에서 서로 섞이지 않는 두 유체(물과 기름)를 동시에 주입하여 구조적인 제한을 주면 피코리터 부피의 미세액적을 초당 천 개 이상 생산할 수 있다. 기존의 일괄 세포처리법에 비해 미세액적 내에서 단일 세포의 세포 별 신호, 활성, 반응 등의 여러 정보를 동시에 받을 수 있는 장점이 있다. 특히, 조직공학이나 생체모방 등에 쓰였던 수화젤 폴리머를 원료로 사용해 단일 세포가 포함된 미세액적을 생산하고 이를 고체화시키면 수화젤 미세캡슐을 고속 생산할 수 있다. 수화젤 미세캡슐은 미세액적에 비해 액체 용매에서의 조작이 가능하기 때문에 세포 배양액을 지속적으로 주입할 수 있으므로 세포 생장률 유지 및 장시간 배양이 가능하다.
본 학위과정에서는 연못이나 저수지 등에서 서식하는 Chlorella vulgaris, Chlamydomonas sp., Botryococcus braunii 등의 3종의 담수 녹조류 종을 동일한 크기(평균 25마이크로미터 지름)의 알지네이트 수화젤 미세캡슐에 단일 세포 단위로 캡슐화하고 이 중에서 지질 함량이 높은 단일 조류세포를 선별하기 위한 스크리닝 플랫폼을 개발하였다. 단일 조류세포 내의 지질 함량을 현장에서 즉시 측정하기 위하여 세포 내 지질을 선택적으로 염색할 수 있는 형광 염료인 BODIPY를 세포에 염색하였다. 형광 현미경을 사용하여 종간 및 개체간의 지질 함량을 현장 측정한 후에 높은 지질 함량을 가지는 단일 조류세포가 캡슐화된 미세캡슐을 선택적으로 선별하였다.
동일한 크기의 알지네이트 수화젤 미세캡슐을 고속 생산하기 위하여, 본 연구에서는 미세다리(microbridge) 구조를 집적한 미세채널을 제작하였다. 기존에는 수화젤 미세캡슐이 고체화되기 이전에 이웃하는 미세액적의 간격이 충분하지 않으면 고체화되면서 응집되는 현상이 있었으나, 하나의 미세채널과 이를 연결하는 미세다리 구조를 집적하여 추가적인 오일 흐름을 유발하면 미세액적의 간격을 늘렸다. 오일 유속이 증가함에 따라 미세액적의 간격 역시 증가하는 결과를 관찰하였다. 알지네이트 수화젤을 단시간 내에 고체화할 수 있는 칼슘 이온을 오일에 혼합 및 주입하면서 미세액적의 간격을 증가시킴과 동시에 수화젤 미세캡슐로 고체화하였다.
특정 미세캡슐을 인터랙티브하게 선별하기 위하여 본 연구에서는 광전기유체소자에 미세입자를 포획할 수 있는 마이크로웰을 집적하였다. 빛을 받는 부분만 가상 전극으로 전환할 수 있는 광전기유체소자의 장점을 활용하여, 광전기유체소자 내에 집적된 마이크로웰 중에서 특정 마이크로웰에만 빛 미세패턴을 조사하여 마이크로웰 내의 특정 미세입자에 음의 유전영동을 유발하도록 설계하였다. 20 Vpp, 100 kHz의 AC 전압 하에서 빛 미세패턴에 조사된 특정 마이크로입자는 z축 방향의 거동이 일어남을 관찰하였고, 광전기유체소자에 미세채널을 추가 집적하여 선별된 미세입자를 미세유체의 흐름에 의해 배출구에서 수득할 수 있도록 설계하였다.
끝으로, 알지네이트 수화젤 미세캡슐 내에서 BODIPY에 염색된 3종의 미세조류의 지질 함량을 분석하였다. 형광 반응을 관찰하여 앞서 발표된 문헌과 동일하게 수화젤 미세캡슐 내에서도 Botryococcus braunii, Chlamydomonas sp., Chlorella vulgaris 순으로 지질함량이 높음을 증명하였다. 종간 차이뿐만 아니라 동종 세포 중에서 개체 간의 지질 함량 차이 또한 확인할 수 있었으며 지질 함량이 높고 낮음에 따른 조류세포의 프로파일링을 수행하였다. 이는 기존의 일괄 세포처리법에서는 수행하기 어려운 결과이다. 또한 미세캡슐 내에서의 단일 세포의 생장률을 SYTOX 형광염료를 사용하여 측정한 결과 70% 이상의 생장률을 보임을 확인하였다.
본 연구에서 제안한 담수 녹조류의 개체 간 지질 함량의 프로파일링과 지질 함량이 높은 조류 종의 선별을 위한 미세액적 기반의 스크리닝 기술은 전 세계적으로 최초의 시도이다. 기존의 일괄 세포처리법에 비해 단일 세포 단위로 지질 함량을 평가할 수 있으며, 형광 유세포 분석기(FACS)에 비해 높은 생장률을 유지할 수 있다는 장점이 있다. 또한 미세액적 플랫폼을 활용하여 높은 처리율 하에서 고속 스크리닝이 가능하다.
