A neurological disorder is a disease of the body nervous system caused from the structural, biochemical or electrical abnormalities in the brain, spinal cord or other nerves. It comprises brain diseases including cerebrovascular disease, a heterogeneous complex disease from the interaction between various genetic and environmental risk factors, and Parkinson’s disease, a neurodegenerative disease caused by the death of the brain cells producing dopamine molecules. To understand the underlying molecular mechanisms of neurological disorder progression and treatment, the genomic and epigenomic basis of the disease must be analyzed collectively in terms of biological function and pathway relationships. To this end, an efficient bioinformatics tools including database system integrating genetic variants and related annotation, and other informatics tools to help experimental studies or data analysis are indispensable. In this research, I conducted three bioinformatics approaches to help and contribute to the studies on the genetic and pathological mechanisms of neurological disorders in terms of the genomics, functional genomics and epigenomics layers.
First, in terms of genomics for neurological disorder study, I developed SigCS base, an integrative genetic information database for human cerebrovascular disease. The genetic variants, annotations, and bibliographical information of cerebrovascular disease and its etiologies were extracted from the public resources, integrated in terms of biological function and pathway relationships, and stored into the relational database with efficient retrieval system. SigCS base allows researchers studying the mechanisms of cerebral stroke to evaluate thousands of genomic variants and genes associated with stroke and its etiologies, as well as relevant annotations. Researchers can also select candidate genes or variants for their studies, compare their genetic factors with previously reported results, and examine the pathways contributing the pathological mechanisms. Currently, 1,943 reported human cerebrovascular disease and etiology-related genes with 14,472 genomic variants and 165 candidate pathways are collected and stored in SigCS base.
Second, in terms of functional genomics for neurological disorder study, I developed AsiDesigner, a small interfering RNA (siRNA) design server adopting a new siRNA design algorithm considering alternative splicing for the functional studies of neurological disorder related genes. RNA interference (RNAi) through the post-transcriptional gene silencing with siRNA has become a powerful tool in functional and medical genomic research. In order to apply RNAi technique to eukaryotic organisms, we need spliced mRNA isoform-level gene silencing to examine the specific function of individual proteins. The algorithm developed in this study provides numerous effective functions including the designing of common siRNAs for the silencing of more than two mRNAs simultaneously, a scoring scheme to evaluate the performance of designed siRNAs by adopting currently known key design factors, a stepwise off-target searching with BLAST and FASTA algorithms, and checking the energy for secondary structure folding of siRNAs.
Third, in terms of epigenomics for neurological disorder study, to get the fundamental insights about the epigenetic contribution of the methylation and hydroxymethylation of cytosine in DNAs during the recovery of the brain neurons after stroke events, I analyzed the variation of the DNA methylation and hydroxymethylation patterns using Next-Generation Sequencing technologies with an in vitro model system of gradual differentiation of human embryonic stem cells into ventral midbrain-type neural precursor cells, and terminally into dopamine neurons. In the results, I observed dramatic genome-wide changes in DNA methylation and hydroxymethylation patterns during lineage commitment especially in promoters, exons and enhancers. DNA hydroxymethylation within the gene body was associated with gene activation. The neurogenesis-related genes, NOTCH1, RGMA and AKT1 acquired DNA hydroxymethylation in the gene body were up-regulated during differentiation. DNA methylation in the promoter was associated with gene repression. The pluripotency-related genes, POU5F1, ZFP42 and HMGA1 acquired 5mC in their promoters and were down-regulated during differentiation. Promoter methylation also acted as a locking mechanism to maintain gene silencing. The mesoderm development-related genes, NKX2-8, TNFSF11 and NFATC1 acquired promoter methylation during neural differentiation even though they were already silenced in human embryonic stem cells.
The integrated genetic information database for cerebrovascular diseases and the siRNA design algorithm considering alternative splicing must be useful for studies of genetic causal factors and pathological mechanisms of the neurological disorders in informatics and experimental researches. Also, the findings about the role of the DNA methylation and hydroxymethylation during the neuronal cell differentiation will help elucidate the molecular mechanisms underlying lineage-specific differentiation of pluripotent stem cells during human embryonic development or stem cell-based treatment for the recovery from the neurological disorders.
뇌질환 또는 신경계 질환은 광범위한 신경계의 구조적, 생화학적 또는 전기적 비정상에 의한 복잡한 신경계 관련 질병으로서 뇌혈관 질환이나 파킨슨병을 포함한다. 그 중 뇌혈관 질환은 다양한 유전적 소인 및 환경적 위험 요소와 원인 질병들간의 복잡한 상호작용에 의해 뇌혈관이 막히거나 파열되어 발생하며, 파킨슨병은 중뇌 영역에서 주로 도파민 생산 관련 신경세포들의 사멸에 의해 발생하는 퇴행성 뇌질환으로서, 발병 원인과 기작 연구에 상당한 어려움이 있다. 뇌질환의 분자적 기작을 효과적으로 연구하고, 치료에 적용하기 위해서는 산발적으로 연구 보고되고 있는 뇌질환 관련 유전적 변이, 유전자 기능 및 관련 정보들을 체계적으로 종합하여 연구자들에게 제공할 수 있는 유전정보 데이터베이스와 다양한 생물정보학적 도구들의 지원이 필요하다. 또한, 뇌질환의 근본적 원인치료를 위해서 뇌세포의 정상적 분화와 활동과정에 있어서 후성학적 발현조절에 관한 이해가 선행되어야 하며, 유전체학, 기능유전체학, 후성유전체학을 포함하는 다차원적 연구가 종합적으로 수행되는 것이 효과적일 것이다. 본 연구에서는, 뇌혈관 질환 관련 유전 변이 정보, 엑손 구조정보, 차세대 서열분석 기술을 적용하여 구한 DNA 메틸화와 수산화 메틸화 단편서열 정보를 기반으로 뇌혈관 질환 유전변이 정보 데이터베이스를 구축하고, 유전체 기능연구 지원을 위한 새로운 siRNA 설계 도구를 개발하며, 뇌세포 분화과정에서 DNA 메틸화와 수산화메틸화의 후성학적 역할을 고찰 함으로써, 뇌질환의 유전적 원인과 병리기작 이해를 위한 유전학, 기능 유전체학 및 후성유전체학적 요인 연구를 생물정보학 측면에서 지원하고자 하였다.
첫째, 유전체학적 측면의 뇌질환 연구지원을 위하여 뇌혈관 질환 종합 유전정보 데이터베이스를 개발하였다. 현재까지 보고된 뇌혈관 질환과 병인들에 대한 유전적 변이, 유전자 정보, 기능주석, 표현형, 문헌 정보들을 공개 데이터베이스들로부터 추출하여 정리하였으며, 생물학적 경로를 분석하여, 관계형 데이터베이스로 구축하고, 웹 검색시스템을 구현하였다. 뇌혈관 질환과 병인들에 연관된 것으로 보고된 유전정보들을 효과적으로 검색할 수 있으며, 신규 연구대상 유전자의 선택, 연구중인 유전적 변이들의 동정, 병리적 기작관련 생물학적 경로 검색 등의 지원을 통하여 뇌혈관 질환의 원인과 분자생물학적 병리기작 연구를 효과적으로 지원할 수 있다. 현재 뇌혈관 질환과 병인 관련 1,943 종의 유전자들과 유전 변이 정보, 그리고 이들을 기반으로 분석한 165 종의 생물학적 경로가 저장되어 있다.
둘째, 기능유전체학적 측면에서 뇌질환 연관 유전자들의 기능연구를 돕기 위한 생물정보학적 도구로서, 선택적 스플라이싱을 고려한 siRNA설계 알고리즘을 개발하였다. 뇌질환 관련 유전자들의 기능을 구체적으로 연구할 수 있도록 특정 발현체 또는 발현체들의 조합에 대하여 발현을 억제할 수 있는 siRNA를 설계할 수 있으며, 설계된 siRNA들의 성능예측을 위하여 현재까지 알려진 주요 성능관계 변수들 중 통계적 연관성을 기반으로 선정한 5종의 요소들에 대하여 가중치를 적용한 성능 예측 모델을 고안하여 적용하였고, 유전자 발현 억제 실험을 통하여 성능을 확인하였다. 인간은 물론 2종의 모델 생물에 대한 siRNA 설계를 지원하도록 구현하여, 뇌질환 연관 후보 유전자들의 기능을 발현체 수준에서 정밀하게 연구할 수 있는 기반을 마련하였다.
셋째, 줄기세포 기반의 뇌질환 치료연구에 있어서 후성유전체학적 측면의 기반 지식을 확보하기 위하여, 뇌세포 분화과정에서 DNA 시토신 염기의 메틸화 및 수산화메틸화와 유전자 발현과의 관계를 도파민 신경세포의 분화과정을 통한 in vitro모델을 이용하여 차세대 염기서열 분석기술을 기반으로 분석하였다. 신경세포의 분화과정에서 DNA 메틸화와 수산화메틸화의 패턴이 전장 유전체 차원에서 심한 변화를 보였으며, DNA 메틸화는 주로 유전자의 프로모터와 엑손, 그리고 인핸서 영역에서 크게 변화 하였고, 수산화메틸화는 유전자 본체 영역의 변화가 유전자의 활성화에 기여하는 것을 확인하였다. 분화과정에서 신경발달 관련 유전자인 NOTCH1, RGMA, AKT1 등이 유전자 본체 영역에서 수산화메틸화가 이루어지면서 발현이 증가하였고, 줄기세포의 분화능 관련 유전자들인 POU5F1, ZFP42, HMGA1등은 프로모터 영역의 메틸화를 통하여 발현이 억제되었다. 또한, 줄기세포에서 이미 발현이 억제되어 있는 중배엽 분화 관련 유전자들인 NKX2-8, TNFSF11, NFATC1등이 신경세포로의 분화 과정에서 메틸화를 통하여 발현이 잠기는 현상을 확인하였으며, 분화에 따른 발현 변화 유전자들을 이용한 생물학적 경로분석을 통하여 뇌세포 분화 과정에서 DNA의 메틸화와 수산화 메틸화가 분화관련 유전자들의 발현 조절에 후성학적으로 기여하면서 주도적 역할을 하고 있음을 확인하였다.
본 연구를 통하여 구현된 뇌혈관 질환 관련 종합 유전정보 데이터베이스와 선택적 스플라이싱을 고려한 siRNA 설계 알고리즘은 뇌질환 관련 유전정보를 검색 및 비교하고, 연구 대상 유전자를 선택하거나, 연구를 통하여 밝혀진 유전적 변이의 병리학적 기여를 기능적으로 연구하는데 있어서 효과적인 도구로 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 인간 배아 줄기세포로부터 도파민 신경세포로의 분화과정 연구에서 얻은 DNA 메틸화와 수산화메틸화의 유전자 발현조절 관련한 발견은 인간 배아발달 과정에서 뇌조직의 분화에 있어서 분자적 기작 연구에 도움을 줄 수 있을 것이며, 나아가 줄기세포를 이용한 뇌질환 치료 연구에 있어서 뇌조직 회복의 분자적 기작 연구에 중요한 기반지식이 될 수 있을 것이다.
