This thesis proposes a well-designed microfluidic system with hydrodynamic control of microdroplets can serve as a simple, feasible, and beneficial platform for biological assay. The selected experiment to assess practicability of pico to nanoliter microdroplet system is the assay for screening gene library inside Escherichia coli (E.coli). Cell-based screening is conventionally carried out in test tubes or well plates in which single cell isolation or reaction can be hardly achieved. The single-cell based assay platform requires the process of single-cell isolation, mixing with reagents for identifying certain gene expression, incubation with supplementary cell media, and recovery of the reacted cells for further analysis.
This work proposed that microdroplets generated in two-phase fluid are the most compatible tool for single-cell isolation, and the method of secondary breakup of droplets to encapsulate single cells inside microdroplets is first introduced. The secondary breakup of droplet which is obtained from the conventional microchannel for droplet generation, into smaller sizes by simple integration of micro-groove structures or a pinched flow. While conventional microfluidic tool achieves single-cell isolation efficiency of less than 30%, droplets obtained from the secondary breakup collects about 50% of single-cell containing droplets, and the proportion of multiple-cell containing droplets are kept less than 16%.
Mixing with reagents or supplementary cell media for droplet-based microfluidics requires merging events of droplets. Here we report the use of the abacus-groove structure for sequential addition of droplets. The abacus channel brings droplets together in a chamber with a control channel, which is analogous to biasing in electronics to change the pressure difference in the chamber and precisely determine the number of added droplets with no external forces integrated to the system other than syringe pumps. This method for droplet merging can be applied in addition of single type of droplets into various numbers, addition of two droplets at different ratio, and sequential merging and transport of droplets in multiple chambers serially connected with each other.
Finally, we created a platform for microdroplets which integrates multiple functions including easy trapping and consistent addition of droplets. We aligned a mesh-grid structure over the microwells which acts as a microchannel structure with an open access, and created a stable microdroplet array. The mesh-grid as a microchannel aids in guiding the trace of droplets into the microwells underneath for stable storage, and the open system enables integration of additional manipulation tools to each droplet. With the device, more than 80% of the wells are filled with single-cell droplets, and the following process of droplet-merging,incubation, and selective recovery of droplet was successfully demonstrated in one platform. Each droplet in the array forms a stable environment of pico-liter volume for cell-to-cell reactions and cell based screening application in single cell units.
In this thesis, integration of each functioning tool of microdroplet system, which is a main bottleneck of the recent microfluidic technology, is realized to completely carry out the whole process of biological assay. This technique is expected to provide a microfluidic method not only for cell screening application but also in various applications which requires handling of small volume of materials. Furthermore, this work has created a novel environment to study interaction between the single cells in high throughput manner, and is expected to be applied to fast screening of microbial cells directly obtained from nature, of which more than 99% in existence cannot be cultured with conventional laboratory system.
본 학위논문은 미세액적의 유체역학적 제어를 위해 설계된 미세유체기반 시스템은 생물 기반 분석의 수행을 위한 간단하고, 적합하며, 유익한 플랫폼을 제공할 수 있음을 논한다. 피코에서 나노리터 크기의 미세액적의 실용성을 보일 수 있는 적용분야로는 Escherichia coli와 같은 미생물 내의 유전자 라이브러리 스크리닝 실험이 있다. 세포 기반의 스크리닝 실험은 기존의 시험관이나 마이크로웰 플레이트에서 행해지고 있으나 단일 세포 단위의 세포 분리나 반응을 수행하기는 어렵다. 단일 세포 기반 실험을 위한 플랫폼은 단일 세포의 분리, 특정 형질의 발현을 유도 또는 감지하기 위한 약물의 처리, 세포 배지의 공급 및 장시간 동안의 배양, 추가 분석을 위한 반응 세포의 수거 등의 조작이 가능하여야 한다.
먼저 이 연구에서는 이상 유체에서 생성되는 미세액적이 단일 세포 단위의 분리를 위해 가장 적합한 수단이 될 수 있음을 제안하고 액적의 이차 분쇄 방법을 소개하였다. 이차 분쇄 방법이란 기존의 미세액적 생성을 위한 미세유체 채널 내에 미세홈 구조들을 연결하거나 핀치형 유동을 도입하여 미세액적을 한 번 더 작은 크기로 분쇄하는 방법이다. 기존의 미세공정 또는 미세유체조작에 의한 방법에서는 단일 세포로의 분리 효율이 30%가 채 되지 않으나, 액적의 이차 분쇄 방법으로는 단일 세포를 포함한 액적을 50% 정도 수거할 수 있었으며, 다수의 세포를 포함하는 액적의 비율을 16% 이하로 낮추었다.
액적 기반 미세유체 시스템에서 반응물 또는 세포 배지의 공급을 수행하기 위해서는 액적이 합쳐질 수 있어야 한다. 이 연구에서는 주판형 홈 구조를 이용하여 미세액적이 모여 합쳐질 수 있도록 하였고, 전기회로의 바이어스와 같은 역할을 할 수 있는 컨트롤 채널을 통해 채널 내의 압력차를 변화시켜 추가적인 외부힘의 작용 없이도 합쳐지는 액적의 개수를 조절하였다. 이 주판형 구조는 한가지 액적을 다른 개수로 합치거나, 다른 종류의 액적을 다른 비율로 합칠 수 있으며, 연결된 여러개의 채널 공간 안에서 순차적으로 액적을 합치고 이동시킬 수도 있다.
마지막으로 본 연구에서는 미세액적을 손쉽게 모아 가두고 지속적으로 다른 액적과 합치기 위한 플랫폼의로의 통합 기술을 개발하였다. 미세 액적을 보관하기 위한 마이크로웰 어레이 위에 그물망 형태의 격자구조물을 정렬하여 열린 형태의 미세채널 구조가 결합된 미세액적 보관 어레이를 제작하였다. 이 격자구조물은 미세액적의 이동 경로를 보조해주어 미세액적이 마이크로웰에 안정적으로 가둬질 수 있도록 하는 동시에, 열린 구조이기 때문에 다른 추가적인 미세액적의 조작 및 다른 디바이스와의 연계가 가능하다는 장점을 가진다. 이 격자구조물이 정렬된 플랫폼을 이용하여 80% 이상의 마이크로웰에 단일 세포가 포함되어 있는 어레이를 형성할 수 있었으며, 미세액적 간의 혼합, 장시간 배양 및 선택적인 액적의 수거 등의 기능이 한 디바이스에서 구현되도록 하였다. 어레이 내 피코리터 부피의 액적 각각은 단일 세포 단위에서의 세포간 상호작용이 일어나거나 세포 기반 스크리닝으로의 적용에 적합한 안정된 환경을 구축하였다.
본 학위논문에서는 최근 미세유체기반 기술이 극복해야 할 과제로 여겨지는 응용분야로의 적용을 위한 다양한 기능들의 통합 문제를 미세액적 기반 기술의 개발을 통해 해결하고자 하였다. 먼저 미세액적을 단일 세포 스크리닝에 필요한 여러가지 기능을 구현함으로써 미세유체기반 플랫폼이 실제로 다양한 응용분야 쓰일 수 있는 가능성을 보였다. 더 나아가서는 단일 세포 단위의 상호 작용 반응을 대량으로 관찰할 수 있는 새로운 미세 환경을 만들었다는 의미를 가지며, 기존 실험실에서는 배양이 불가능한 현존하는 99% 이상의 미생물을 바로 캡쳐하여 고속으로 스크리닝 하기 위한 기술의 토대가 될 것으로 기대된다.
