Class I Phosphoinositide 3-kinases (PI3Ks) and Ras and Rho family small GTPases are key regu-lators of processes such as cell polarization, motility and chemotaxis. Class I PI3Ks are comprised of four p110 catalytic subunits (p110α, p110β, p110γ, and p110δ). These signaling components influence each other’s activities by direct and indirect feedback processes that are only partially understood. A number of studies have shown that PI3Ks are activated by Ras and Rho family small GTPases, but little is known about isoform-specific activation of the four PI3K isoforms.
In chapter 1, I identified 21 small GTPase homologs activate PI3K. K-Ras, H-Ras and five other homologs function upstream of PI3K and directly bind the PI3Ks catalytic subunit, p110. In addition, three Rac isoforms and 11 other small GTPase homologs activate PI3K by indirect feedback mecha-nisms. Furthermore, a large portion of PI3K activation was generated by positive feedback that did not result from the activity of a single small GTPase but was instead the result of cooperation between several Rho family small GTPases that together form a distributed network to reinforce PI3K activity. This model explains the past challenges in elucidating the relevance of specific small GTPases in processes such as cell polarization and chemotaxis.
In chapter 2, I show that Ras and Rho family small GTPases interact with and activate PI3Ks in an isoform-specific manner. Using a recently developed protein-protein interaction assay, I visualized the interaction between 21 PI3K-activating small GTPases and the four PI3K isoforms. Surprisingly, I found that Ras family small GTPases bind to p110α, p110γ?? and p110δ, whereas Rho family small GTPases bind to p110β. These isoform-specific interactions with different subfamilies of small GTPases lead to the isoform-specific functions of PI3K, as shown by the translocation of PHAKT1. Furthermore, to induce cell migration, I discovered that Ras family small GTPases initially activate PI3K via the p110α?? isoform, and that the Rho family small GTPases act through a positive feedback loop to further activate PI3K via the p110β isoform. Our results provide a novel feedback loop for the regulation of cell migration by Rho family small GTPases and demonstrate that PI3K isoforms are comprehensively activated by Ras and Rho family small GTPases.
Regulator of Calcineurin 1 (RCAN1) is a key regulator of the calcineurin-NFAT signaling net-work in organisms ranging from yeast to human, but its functional role is still under debate since differ-ent roles of RCAN1 have been suggested under various experimental conditions.
In chapter 3, I employed a systems approach by combining single cell experimentation with in silico simulations to elucidate the mechanisms underlying the RCAN1 regulatory system. In particular, I found that the nuclear export of GSK3?? that switches on the facilitative role of RCAN1 in the calcineu-rin-NFAT signaling pathway is promoted by PI3K signaling. Based on this, together with integrated information from previous experiments, I developed a mathematical model that revealed that the functional role of RCAN1 changes in a dose-dependent manner: RCAN1 functions as an inhibitor when its levels are low, but as a facilitator when its levels are high. Furthermore, I identified a hidden incoherent regulation switch mediating this role change, which entails negative regulation through RCAN1 binding to calcineurin and positive regulation through sequential phosphorylation of RCAN1.
Phosphoinositide 3-kinases (PI3Ks)와 Ras, Rho family small GTPases 는 세포의
이동, 증식등 세포의 기능에 있어서 주요 신호전달의 매개체로서 중요한 역할을 한다.
이중에서도 가장 중요하게 연구되고 있는, Class I PI3K 이성체들은 4 가지로 구성된다
(p110α, p110β, p110γ, and p110δ). 이러한 PI3K 이성체들과 small GTPases 는 또한
서로의 활성에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 주고 있다. 그렇기 때문에, 이들의
관계에 대하여 연구가 활발히 진행되고 있고, 발표된 연구도 많지만, 아직 PI3K 이성체들과
small GTPases 들에 연관성에 대하여 밝혀지지 않았다. 본 학위논문의 1 장과 2 장에서는
PI3K 이성체들이 어떻게 small GTPases 에 의하여 활성화 되는지에 대하여 심도 깊게
다루고 있으며, 부록에서는 논란이 많은 RCAN1 의 기능을 시스템적인 관점에서 분석하고,
왜 서로 다른 기능이 보고 되고 있는가에 대하여 다루고 있다.
제 1 장에서는 Akt1 의 PH 도메인 (PIP3 바이오센서) 을 사용하여, 100 개의 small
GTPases 중에서 PI3K 를 활성화 시키는 21 개의 Ras 와 Rho family small GTPases 밝혔다.
또한, 최근에 개발된 InCell SMART-i (IntraCellular SupraMolecular Assembly Readout
Trap for interaction) 기술을 통하여, 21 개의 PI3K 활성 small GTPases 중에서 7 개의 Ras
small GTPases 들이 PI3K 와 직접적으로 결합하여 PI3K 를 활성화 시키는 것을 보여주고
있다. 그리고 나머지 14 개의 small GTPases 들 중에서, 6 개의 Rho family small
GTPases 들은 PI3K 의 downstream 에서 positive feedback 을 통하여 PI3K 를 활성화
시키는 것을 알 수 있었다. 또한, 이러한 positive feedback 이 생성되기 위해서는
downstream Rho family small GTPases 들이 협력적으로 활성화 되야 하는 것을 제시하고
있다.
제 2 장에서는 1 장에서 소개한 21 개의 PI3K 활성 small GTPases 들이 서로 다른
PI3K 이성체를 활성시켜서, PI3K 이성체에 따라 다른 기능을 형성하게 되는지에 대하여
연구한 내용이다. Ras family small GTPases 는 p110α, p110γ, and p110δ 와의 결합하였고,
Rho family small GTPases 는 p110β 와 결합한 것을 밝혔다. 더욱이, 이러한 이성체
특이적인 결합이 Ras 와 Rho family small GTPases 에 따라 PI3K 이성체 특이적인
활성화와도 관련이 있는 것을 보여주고 있다. 이러한 이성체 특이적인 결합과 활성은 세포의 이동과 관련이 있었다. 즉, 효율적인 세포의 이동을 유도하기 위해서는 Ras family small
GTPases 에 의하여 p110α 의 활성화되고, Rho family small GTPases 에 의해서 p110β 를
통해 PI3K 더욱 활성화 되어야 한다는 것을 제시하고 있다.
부록에서는 calcineurin-NFAT 신호전달체계에 있어서 주요 조절장치인 Regulator of
Calcineurin 1 (RCAN1)에 대하여 연구한 내용이다. 컴퓨터 모델링과 실험을 통하여
시스템적인 관점에서 접근하여 지금까지 서로 다른 기능이 보고 되었던, RCAN1 이 어떻게
서로 다른 작용을 하게 되는지에 대하여 보여주고 있다. 특히, RCAN1 이 calcineurin-NFAT
신호를 촉진하는 기능을 가지게 하는 GSK3b가 PI3K 의 신호전달에 의해서 핵 밖으로
유도된다는 것을 실험적으로 밝히고, 이러한 새로운 발견과 기존의 실험문헌에 기반하여
calcineurin-NFAT 수학모델을 개발하였다. 그리고 이렇게 개발된 모델을 이용하여
RCAN1 이 농도에 의존적으로 기능이 변화된다는 것을 밝혔다. 즉, RCAN1 의 농도가 낮을
때는 calcineurin-NFAT 신호전달을 억제하고, 반대로 농도가 높을 때에는 calcineurin-
NFAT 신호전달을 촉진한다는 것이다. 더욱이, 구조적으로 incoherent feedforward 가
RCAN1 의 이러한 이상성을 가지게 한다는 것을 제시하고 있다.
1, 2 장에서 다루어진, PI3K 의 이성체들이 Ras 와 Rho family small GTPases 에
의해서 어떻게 활성화되는지에 대하여 전반적으로 연구한 이 연구는, 세포가 이동하는데
있어서 어떻게 PI3K 활성을 한쪽으로 극성시킬 수 있는지, 또한 여기서는 자세히 다루어
지지 않았지만, Ras family small GTPases 유도 암에 있어서 PI3K 이성체들의 역할에
대하여 근본적인 해답을 제시 해줄 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 부록에서 다루어진
RCAN1 의 이상성 성질은, 시스템적인 관점에서 RCAN1 의 기능에 대한 기존의 상반된
결과들을 잘 설명해 줄 수 있고, 더 나아가서는 calcineurin-NFAT 신호전달이 관련되는
여러 현상들을 설명 해 줄 수 있을 것으로 기대된다.
