This thesis presents tapered slit filters for high-throughput viable circulating tumor cell (CTC) isolation. The previous biochemical CTC isolation methods, based on surface-specific antibody bindings, showed different capture efficiencies depending on tumors with the reduced cell viability due to irreversible antibody binding. The previous physical CTC isolation methods, using straight hole filters, generated stress concentration in the captured CTC; thus resulting in cell damage and rupture. In this thesis, we propose a membrane filter having tapered slits to achieve high-throughput and viable CTC isolation with the minimal cell stress reduced to 18% of the stress generated in straight hole filters.
We design two types of tapered slit filters, Filter 6 and 8, respectively containing the tapered slits hav-ing the outlet width of 6 and 8μm at the slit density of 34,445/cm2 on a membrane. We decide the outlet widths of the tapered slits considering the size and deformability of the cells in blood. We fabricate the slits having tapered angle of 2 degree on SU8 membrane by adjusting UV expose dose and the air gap between the membrane and photomask.
The performance of the fabricated tapered slit filters have been characterized using the human lung cancer cells (H358G), spiked in PBS (Phosphate buffered saline) and diluted blood (blood:PBS=1:4), respec-tively. Filters 6 and 8 capture the cancer cells spiked in PBS at the efficiency of 89.87% and 80.34% at the sample flow rate of 5ml/h, respectively. Viable cells are collected from the cells captured by Filter 6 and 8 at the recovery rates of 59.14% and 72.99%, respectively; thus showing the viability of 70.24% after 5-day cell culture on the membrane filters. At the increased flow rate of 10 ml/hr, the capture efficiencies were de-creased by 20% and 62 % for Filter 6 and 8, respectively. The best cell isolation conditions of the PBS sample test is found at the flow rate of 5ml/h using Filter 6, and is used in the diluted blood sample test. Filter 6 have shown the cancer cell capture efficiency of 75.42% and the recovery rate of 36.04% at the diluted blood flow rate of 5ml/hr with the cell viability of 72.33% after 5-day culture.
It is concluded that the tapered slit filters demonstrate high-throughput viable cell isolation capability; thereby inaugurating further advanced CTC research for cancer diagnosis and prognosis.
본 연구에서는 경사진 슬릿을 평판상에 배열하여 혈중암세포의 고속 활성유지 선별이 가능한 필터소자를 제안하였다. 최근 암 진단 및 예후예측 분야에서 조직검사 없이 말초혈액 내 혈중암세포의 유무 및 개수 변화를 비교 분석하여 암의 병기 및 치료에 따른 효험을 확인하기 위한 연구가 중요시 되고 있다. 이를 위해서는 말초혈액 내에 존재하는 혈중암세포를 고속으로 활성유지 선별하는 것이 필수적이나 기존의 혈중암세포 특이 항원항체 반응을 이용한 화학적 방식으로는 반응의 비가역성으로 인해 활성유지 선별이 불가능했다. 뒤이어 제시된 물리적 특성 기반의 기존 일자형 평판필터의 경우, 필터 모서리에서 세포의 집중된 인장 응력으로 인해 고속 처리시 세포의 손상이 불가피하였고, 이를 개선하고자 제안된 경사진 미소기둥(Micropillar array) 방식의 경우 단위면적 당 기둥 개수의 제한으로 고속 선별이 불가능했다. 이에, 본 연구에서는 경사진 슬릿을 평판상에 배열함으로써 필터 모서리에서의 세포가 받는 집중된 인장 응력을 약 83% 감소시키고 처리량을 향상시켜 혈중암세포의 활성유지 선별이 가능한 필터소자를 제안하였다. 아울러, 제안된 필터소자는 폴리머 기반 감광액(SU8)에 자외선을 노광시키는 방법으로 값싸고 병렬적으로 제작할 수 있는 장점이 있다.
제안된 필터소자는 SU8 소재의 필터층과 PDMS (Polydimethylsiloxane) 소재의 챔버층으로 구성되어 있다. 필터층에는 34,445(83X415)개의 경사진 슬릿이 1cm2 면적 내에 배열되어 있으며, 이 필터층만 시료가 분포될 수 있도록 챔버층 2개가 필터층을 감싸고 있다. 상기 슬릿의 너비, 6um와 8um를 갖는 Filter 6과 Filter8, 2종을 설계하였으며, 자외선의 노광량, 마스크와 SU8 사이의 거리를 조절하여 경사진 슬릿을 갖는 필터층을 제작하였다.
제안된 필터소자의 성능평가를 위해H358G 폐암세포주를 PBS (Phosphate buffered saline)와 희석된 혈액 내에 주입한 시료 2종에 대하여 실험을 하였다. 암세포 PBS 주입실험에서는 시간당 5ml의 유량으로 실험한 결과, 89.87%와 80.34%의 암세포가 Filter 6과 Filter 8에서 각각 포획됨을 확인하였다. 시간당 10ml의 유량에서는 약 20%와 62%의 포획효율 감소가 Filter 6과 Filter 8에서 나타났으며, 59.14%와 72.99%의 세포가 Filter 6과 Filter 8에서 역류를 통해 회수됨을 확인하였다. 회수 후 남아있는 세포의 5일동안의 활성도는 70.24%가 넘는 것을 보였다. 암세포 희석혈액 주입실험에서는 앞서 진행된 PBS 주입실험에서 최고의 포획효율을 보인 Filter 6소자와 시간당 5ml의 유량으로 진행하였다. 이 조건에서 75.42%의 포획효율, 36.04%의 회수율, 그리고 72.33%의 암세포가 5일 뒤에도 활성을 나타냄을 확인하였다.
본 연구에서는 혈중암세포의 고속 활성유지 선별이 가능한 경사진 슬릿형 필터소자를 제안하고 그 성능을 검증하였다. 제안된 필터소자는 향후 혈중암세포 선별을 위한 키트나 의료장비에 집적 가능하며, 활성유지 선별된 혈중암세포의 배양 및 분자분석을 통해 향후 암진단 및 혈중암세포 관련 연구의 가능성이 더 넓어질 것이라 예상된다.
