PHAs are polymerized by PHA synthase which uses various hydroxyacyl-CoAs as substrates. Among various hydroxyacyl-CoAs, natural PHA synthases generally accept 3-
hydroxyacyl-CoAs (3HA-CoAs) as the most favorable substrates as well as 4-, 5- and 6-
hydroxyacyl-CoAs. However, there has not been any report about 2-hydroxyacid containing PHA in vivo by natural PHA producing bacteria. Natural PHA synthases screened up to date have shown very low or negligible in vitro activities towards 2-hydroxyacyl-CoAs compared with other HA-CoAs. Here we report the biosynthesis of 2-hydroxyacid including glycolate, lactate, 2-hydroxybutyrate (2HB), 2-hydroxyisovalerate (2HIV), 2-hydroxyisocaprate (2HIC) by direct fermentation of metabolically engineered Escherichia coli. For the synthesis of PLGA, heterologous metabolic pathways for the generation of lactyl-CoA and glycolyl-CoA, the substrates of engineered PhaC1Ps6-19, were constructed by the expression of evolved propionyl-CoA transferase and Pasteurella multocida glycerate dehydrogenase. And then lactyl-CoA and glycolyl-CoA were polymerized into PLGA by engineered PhaC1Ps6-19. Furthermore, to enhance PLGA biosynthesis, E. coli metabolism was engineered by knocking out the pflB, frdABCD, adhE genes and by replacing the promoters of the ldhA and acs genes with the trc promoter to increase lactate precursors and was further engineered to increase glycolate pools by knocking out the iclR and aceB genes and by replacing the promoters of the aceA gene with the trc promoter based on in silico genome-scale metabolic flux analysis. Using this engineered strain, P(38.4mol%LA-co-61.6mol%GA) could be accumulated up to 32.6 wt% of polymer content from glucose. Next, biosynthesis of 2HB, 2HIV, or 2HIC containing polymer was examined in the recombinant E. coli ldhA mutant XLdh strain expressing PhaC1Ps6-19 and PctCp by varying the concentrations of 2HB, 2HIV, or 2HIC and 3HB added to the defined medium containing 20 g/L of glucose. PHAs consisting of 2HB, 2HIV, or 2HIV and 3HB were synthesized, monomer composition of which was dependent upon the concentration of monomers fed to the medium. For the synthesis of P(2HB-co-3HB), heterologous metabolic pathway for the generation of 2HB from glucose was constructed via citramalate pathway. 2-ketobutyrate was converted into 2HB by the Lactococcus lactis subsp. lactis Il1403 2- hydroxybutyrate dehydrogenase encoded by the panE gene. When the recombinant E. coli XLdh expressing the phaC1437, pct540, cimA3.7, and leuBCD genes was equipped with the L. lactis Il1403 panE gene, it successfully produced polymer mainly consisting of 2HB up to 18.9 wt% of polymer content from glucose.
폴리하이드록시알카노에이트 (PHAs)는 바이오매스 유래 고분자로 생분해성 플라스틱으로
석유화학유래의 플라스틱의 대체제고 각광받고 있다. 이 PHAs 를 미생물에서의 생합성 시스템을 이용하기 위해서는 PHA synthase 가 가장 핵심 유전자이다. 하지만, 자연적으로 존재하는 PHA synthase 의 경우 3, 4, 5, 6 - hydroxyacry-CoA 를 단량체로 잘 받아들이지만, 2-hydroxyacry-CoA 는 단량체로 잘 받아들이지 못한다. 하지만, 2010 년 우리 연구실에서 개량된 PHA synthase 와 PCT system 을 이용하여 2-hydroxyacry-CoA 인 유산 (lactate)를 고분자 합성하는데 성공하였다. 이번 연구에서는 이 시스템을 기반으로 2-hydroxyacry-CoA (C2 - C6)를 미생물내에서 고분자화시키는 것을 목표로 하였다.
먼저 C2 와 C3 인 유산과 글리코산 (glycolate)의 공중합체인 Poly(lactate-co-glycolate) [PLGA]를 미생물인 대장균에서 합성하는 연구를 진행하였다. 미생물내에서 PLGA 를 합성하기 위해서는 먼저 글리코산을 세포내에서 합성하는 시스템을 구축하여야 한다. 이를 위해서 glycerate dehydrogenase 를 도입하여 글루코산을 합성하였다. 그 다음으로 글리코산의 pool 을 증가시키기 위해서 iclR, aceB 유전자를 제거시키고, aceA 를 증폭시키는 대사공학적 연구를 진행하였다. 이렇게 해서 JLXF8 이라는 균주를 제작하였으며, 이 균주를 통해 PLGA 를 생산한 결과, 야생형균주 대비하여 글리코산의 양은 1.18 배, 고분자의 생성률은 2.65 배 증가하는 효과를 얻을 수 있었다. 그 다음으로는 고분자의 전체적인 생성률을 증가시키기 위해서, 고분자를 분해시켜 미생물의 영양분으로 공급시켜주는 다양한 에스터가수분해효소 (esterase) 를 제거시켰으며, 그 중에서 bioH 라고 명명된 에스터가수분해효소 가 가장 효과적으로 고분자 생성률을 증가시켰으며, 야생형 균주 대비 고분자 생성률은 3.59 배 증가하였다. 이렇게 생성된 PLGA 고분자의 물성과 구조를 검사하기 위해 NMR, GPC, DSC 를 해본 결과 미생물에서 생성한 PLGA 가 화학적으로 합성된 PLGA 와의 물성과 거의 동일하다는 결론을 도출하였으며, 이를 통해 미생물을 통한 PLGA 생산의 가능성을 보여주었다고 생각한다.
또한 C4,C5,C6 를 단량체로 한 미생물내에서의 신규고분자 합성에 대해 연구를 진행하였다. 먼저 C4, C5 C6 를 단량체로 미생물내에서 개량된 PHA synthase 와 PCT 시스템을 이요아여 고분자를 합성할 수 있는지 테스트를 하기 위해 C4 인 2-하이드록시뷰티레이트 (2-hydroxybutyrate), C5 인 2-하이드록시아이소발러레이트 (2-hydroxyisovalerate), C6 인 2-하이드록시아이소카프로레이트 (2- hydroxycaprorate)를 배지내에 공급해주었으며, 그 결과 C4, C5, C6 를 단량체로 한 고분자의 생합성을 확인할 수 있었다. 이 중 C4 인 2-하이드록시뷰티레이트를 글루코스로부터 미생물내에서 생합성하기 위해서 대사회로를 구축하였다. 이 대사회로를 구축하기 위해 citramalate pathway 를 이용하였으며, 이를 위해 cimA, leuBCD, panE 유전자를 벡터기반으로 증폭을 시켰다. 그 결과 2-하이드록시뷰티레이트가 글루코스로부터 대사회로를 통해 합성하였으며, 이는 3-하이드록시뷰티레이트와 공중합체를 이루어서 고분자의 생성량이 60 wt%이며 P(40mol% 2HB-co-60mol% 3HB)인 고분자를 생합성 할 수 있었다.
이번 연구를 통해서 대사공학적 기법을 통해 대장균에서 다양한 고분자를 생산할 수 있는 방법을
제시하였으며, 이는 미생물내에서 다른 신규고분자를 microbial system 을 통해 합성하는 연구에 도움이 될 것으로 생각한다.
