Renewable bioenergy has been playing an increasingly important role as a substitute for fossil fuel energy suffering from its declining supply and CO2 generation. Considering the fact that transportation fuel accounts for about 50% of the world energy consumption, the use of liquid fuel from biomass needs to be expanded substantially. Current biofuels (bioethanol and biodiesel) use edible agricultural commodities as the raw materials, which we share also as food. More biofuels production means more food price increase. Thus, in recent years much attention has been paid to the non-edible biomass for bioenergy production. The main objective of this thesis is to study a feasibility of biodiesel production from microbial lipids accumulated by oleaginous microorganisms from low-cost carbon sources of VFAs (volatile fatty acids) that could be produced with various kinds of waste biomass through anaerobic digestion. Two well-known oleaginous microorganisms, Chlorella protothecoides (Microalgae) and Cryptococcus albidus (Oleaginous yeast) were considered for the microbial lipids production with several low-cost carbon sources. Through a series of experiments and simulations the manufacturing costs of VFAs-based biodiesels were compared with respect to possible productivities in batch, fed-batch and MSC-HCDC (multi-stage continuous high cell density culture) culture systems.
In batch cultures, the optimum culture temperature and pH were tested and the highest lipid content of 47.5% was obtained with urea in C. protothecoides culture. Lipid yield coefficients on VFAs were 0.138 g/g of C. protothecoides and 0.154 g/g of C. albidus, respectively. The theoretical yield coefficient was obtained closely by using VFAs as carbon source in the culture of C. albidus. In the mixture of VFAs, acetic acid showed less inhibitory effect on lipid accumulation than propionic and butyric acid. High C/N ratio in culture medium can provide higher lipid content and lipid production for both strains. The major fatty acids in the lipid produced by C. protothecoides resembled that of palm oil in composition while those of C. albidus were similar to that of soybean oil. In a two-stage batch culture, lipid content increased to 43.8% (w/w) by using VFAs as a sole carbon source in the second stage, which was two times higher than that of batch culture. Furthermore, a two-stage fed-batch cultivation of C. albidus for 192 h produced dry cell weight, lipid concentration and lipid content of 26.4 g/L, 14.5 g/L and 55.1% (w/w), respectively. The fed-batch culture model used here featured pure VFAs solution with intermittent feeding under oxygen-enriched air supply.
Microbial lipid production by oleaginous yeast C. albidus was also carried out by using glucose as an efficient carbon source in continuous cultivation for higher lipid productivity. Under nitrogen-and carbon-limited conditions, the maximum lipid content of 56% (w/w) was observed from the nitrogen-limited culture. In order to develop a high cell density culture (HCDC) which provides higher lipid productivity along with high lipid content, the performance of membrane cell recycling system was investigated. Lipid concentration could be increased up to 38 g/L with lipid content of 55% (w/w) by regulating dilution rate in membrane cell recycling reactor (MCR) with total cell recycle, which is much higher than the lipid concentration obtained in simple continuous culture. Due to the significantly increased cell density, at dilution rate, 0.36/h, the highest lipid productivity, 1.05 g/L/h, was achieved in this system by using total cell recycle, which was over 5 times higher than that of a simple continuous culture. The MCR could also be operated by using partial bleed stream to maintain the steady state for long-term lipid production. At a bleeding ratio of 0.4 and dilution rate of 0.36/h, the lipid productivity could achieve 0.7 g/L/h/.
A simulation study on the reactor performance of lipid production by C. albidus was carried out. The maximum productivity of single-stage CSTR was 0.19 g/L/h at D = 0.05/h. In two-stage CSTR, The highest productivity was 0.26 g/L/h, which was 36% more productive than that of single-stage CSTR under the same feed concentration. To achieve the highest lipid productivity, The multi-stage continuous high cell density culture (MSC-HCDC) system was assumed to be composed of two sections: the first section is for producing high cell density as fast as possible, while the second section can have several reactors in series and in parallel, whose main function is to accumulate microbial lipids in cells as high and fast as possible. By utilizing plug flow reactor (PFR) model in this MSC-HCDC system, the lipid productivity can be improved 10-30 times over fed-batch and simple continuous culture and a lipid productivity of 8 g/L/h was simulated and used for the economic analysis.
A two-stage continuous high cell density culture process for the production of microbial lipids by engineering strain using VFAs and other low-cost substrates as the carbon sources was assumed based on the simulation and experimental data. By employing the fermentation process that was assumed as high lipid yield, content, and productivity of 0.25 g/g, 50 % (w/w) and 8 g lipid/L/h, respectively, an annual lipid production plant capacity of 100000 tonnes was designed and subsequently analyzed. At a value of $ 60/ton for the carbon source (VFAs), a microbial lipids production cost of $0.86/kg was predicted. The single greatest contributor to this value was the cost of raw materials, which accounted for 54% of total estimated operating costs. An analysis of the dependence of production costs on the cost of the carbon source indicated a direct linear relationship, which suggests that a change from $0 to $60/ton in carbon sources cost will result in the range of microbial lipids cost between $0.5 and $0.8/kg. A developed process of biodiesel production was employed to transesterificate the microbial lipids into biodiesel. The total operating costs of biodiesel production were significantly reduced by using VFAs-based lipids as feedstock leading to the biodiesel price of $0.85/L. Finally, an annual land use of 0.0012 m2 /kg was achieved in the production of VFAs-based biodiesel.
본 연구는 아래 내용과 같이 수행되었다. 먼저, 미세조류와 유질 효모에서 유지생산을 위해 저가의 탄소원을 이용하여 실험을 수행 하였다. 실험은 회분식 배양, 유가식 배양, 단일 연속 배양 그리고 다단계 연속 배양 방법을 이용하였다. 또한, 이렇게 생산된 유지로 바이오디젤을 만들었고, 유지에서 바이오디젤을 만들 때의 경제성을 평가하였다.
신재생 바이오에너지는 CO2의 발생과 화석연료의 고갈이라는 문제를 앉고 있는 현 에너지 공급원을 대신하는 중요한 역할을 맡아 왔다. 전세계 에너지 소비의 약 50%가 운송연료로 사용된다는 것을 고려할 때, 바이오매스로 만든 액체 연료의 사용의 필요성은 계속해서 늘어나고 있다. 현재 바이오 연료 (바이오에탄올과 바이오디젤) 는 식용작물을 원료로 연구되어 왔다. 따라서 바이오연료의 생산이 늘어날수록 식용작물의 가격 또한 상승하게 된다. 이를 해결하기 위해 최근 바이오에너지 생산을 위해 비식용작물을 이용하는 것에 대한 관심이 집중되고 있다. 이 논문의 주요 목적은 oleaginous microorganisms이 휘발성 유기산과 같은 저가 탄소원을 사용해 유지(microbial lipid)를 축적시키고 축적된 유지에서 변환된 바이오디젤의 바이오에너지로서의 가능성에 대한 연구이다. 다양한 저가 탄소원과 함께 두 가지 잘 알려진 유지 미생물인, Chlorella protothecoides (미세조류) 와 Cryptococcus albidus (유질효모) 가 유지 생산에 이용되었다. 유지 생산을 위해 회분식, 유가배양식, 다단계 연속 고농도세포배양방식 (Multi-Stage Continuous High Cell Density Culture, MSC-HCDC) 등의 다양한 반응기를 이용한 실험을 수행하였고 휘발성 유기산(Volatile fatty acid, VFA)을 탄소원으로 사용한 바이오디젤 생산의 경제성을 평가하였다.
유기산 플랫폼으로 음식물쓰레기에서 몇 가지 저가 탄소원을 얻는 플라스크 실험을 하였다. C. protothecoides에 비해 C. albidus가 다양한 탄소원에서 더 좋은 지질 축적 능력과 유기산 저해 능력을 보였다. 휘발성 유기산을 사용한 지질 축적에서의 최적 조건을 조사하였다. 휘발성 유기산의 농도와 유기산 포함 비율이 지질 축적에 미치는 영향을 C. albidus를 이용하여 알아보았다. 휘발성 유기산을 탄소원으로 사용한 경우와 포도당을 탄소원으로 사용한 경우 모두C. albidus가 생산하는 지질의 조성은 비슷하였다. 요소를 이용해C. protothecoides 를 회분 배양 했을 때, 최적의 배양 온도와 pH를 조사하고 그때의 최고 지질함량이 47.5%임을 알았다. 이 반응기에서 휘발성 유기산을 이용했을 때 지질 수율은 C. protothecoides에서는 0.138 g/g이었고, C. albidus에서는 0.154 g/g이었다. 배양액의 높은 C/N 비율은 두 종 모두에서 높은 지질 함량과 지질 생산량을 얻는데 기여한다는 것을 보여 주었다.
2단계 배양 실험에서, 다량의 지질을 생산하기 위해 저가 탄소원으로 휘발성 유기산의 사용이 효과적이라는 것을 보여주었다. 충분한 양의 산소를 공급한 2단계 유가 배양 실험에서는 미생물 성장과 유지 생산이 상당히 향상되었고 지질의 함량과 생산성을 높이기 위한 탄소원으로 휘발성 유기산이 가능하다는 것을 보였다. 지질 생산은 2.5L와 5L 규모의 2단계 세포고농도배양을 이용하여 수행하였다. 세포 재사용 연속 배양 (Cell recycling continuous culture) 에서 포도당을 탄소원으로 하였을 때 가장 높은 지질 생산성을 보였다. 수학 모델링으로 분석해 본 결과, 다단계 연속 세포고농도배양 방법은 지질 생산을 위해 탁월한 능력을 보여준다. 2단계 회분배양 반응에서 두 번째 단계에 단일 탄소원으로 휘발성 유기산을 사용했을 때, 지질 함량이 43.8% (w/w) 까지 상승하였고, 이는 회분 배양 반응에서 보다 2배 높은 값이었다. 더구나 2단계 유가 배양 방법으로 192시간 C. albidus을 배양했을 때, 세포건조중량 (Dry Cell Weigh), 지질 농도 그리고 지질 함량이 각각 26.4 g/L, 14.5 g/L 그리고 55.1% (w/w) 임을 알 수 있었다.
높은 지지함량과 생산성을 가지는 고농도 세포배양 (High cell density culture) 실험을 위해 막 세포재사용 시스템 (membrane cell recycling reactor, MCR)을 사용하여 평가하였다, 미생물 전체를 재사용하여 단순 연속배양 반응보다 높은 지질 농도를 막 세포재사용 시스템 반응기는 조절된 희석배수에서 지질 농도가38 g/L, 지질 함량이55%(w/w)로 높게 나타났다. 상당한 세포농도의 증가 때문에 희석배수 (dilution rate) 0.36/h에서 지질 생산성은 1.05 g/L/h로 단순 연속 배양에서 보다 5배 높은 값을 나타내었다. 또한, 막 세포재사용 반응기는 장시간 지질 생산을 위해 부분 배출 (bleed stream )을 사용하여 장상상태 (steady state) 를 유지하였고 0.4의 배출율 (bleeding ratio 과 0.36/h의 희석배수에서 지질 생산성은 0.7 g/L/h를 얻었다. 다단계 고농도세포배양 시스템에서 관형반응기 (plug flow reactor, PFR) 를 이용하면 지질 생산성이 유가배양과 단순 연속배양에 비해 10~30 배 이상 높아질 수 있다. 따라서 시뮬레이션에서 나온 8 g/L/h의 지질 생산성을 경제성 평가에 사용하였다.
2단계 연속 고농도세포 배양공정과 휘발성 유기산 및 다양한 저가 탄소원을 이용한 유지 생산 실험이 수행 되었으며 이를 시뮬레이션 하였다. 지질에서 바이오 디젤을 생산하는 시뮬레이션을 위해 최고 지질 수율은 0.25 g/g, 최고 지질 함량 50% (w/w) 그리고 최고 지질 생산성을 8 g lipid/L/h로 각각 가정하였고 공장 규모는 연간 100000톤의 지질을 생산한다고 디자인하고 그 결과를 분석하였다. 탄소원으로 사용되는 휘발성 유기산의 원료가격을 $60/ton으로 가정했을 때 유지 생산가격은 $0.86/kg으로 나온다. 휘발성 유기산을 이용해 지질을 만들고 이를 다시 바이오 디젤로 생산하는 비용은 유지를 바이오 디젤로 전환하는 에스테르 교환 반응이 첨가된다는 점을 고려하고도 바이오 디젤 생산 전체 운전비용은 $0.85/L로서 상당히 줄어든다는 것을 알 수 있다. 수학 모델링 매개 변수를 기반으로 성장이 빠르고 지질 축적 능력이 뛰어난 재조합 박테리아를 이용하여 경제성 평가를 하였고, 지질에서 생산된 바이오디젤이 현재의 팜 (palm) 와 대두 (soybean)에서 생산되는 바이오디젤과 비교했을 때도 경쟁력이 있다고 보여진다.
