This dissertation presents novel biofabrication strategies for construction of mesoscopic cellular hydrogel scaffolds for bioartificial 3D tissue structures. The ultimate goal of tissue engineering is the restoration of the tissue functions. For the repair or restoration of the tissue functions, the intrinsic macro- to micro-scale 3D environment of the specific tissues is needed to be reconstructed. In conventional methods for 3D tissue engineering, cell aggregations, solid scaffolds, and gel scaffolds have been mainly utilized. However, the controls of microscale 3D environment were lacking or limited in the conventional approaches. Recently, to overcome the limitation, bottom-up tissue engineering, which builds up 3D tissue structures based on meso- to micro-scale cell-containing composites, has been proposed. In this dissertation, I developed facile and distinctive bottom-up tissue engineering methods compared to the related state-of-the-art studies.
At the first parts of the dissertation, on-demand 3D freeform fabrication (FF) strategy was studied by utilizing newly built robotic equipment, the 3D cell-hydrogel bioprinter. By using the 3D bioprinter, cell suspension and collagen hydrogel precursor could be directly dispensed as nanoliter droplets at on-demand 3D locations. A printed layer of collagen, either along or combined with cells, was crosslinked by coating the layer with nebulized aerosol of aqueous sodium bicarbonate. The process was repeated in layer-by-layer fashion, resulting in multi-layered cell-hydrogel scaffolds. By utilizing this 3D FF strategy, multi-layered culture of human skin fibroblasts and keratinocytes, multi-layered rat embryonic neural cells with desired 3D cell patterns, and perfusible fluidic hydrogel scaffolds were demonstrated.
At the latter parts of this dissertation, facile 3D micromodular fabrication (??MF) strategy was proposed through construction of free-standing cellular hydrogel micromodules, mainly in sheet forms. The aim of the 3D ??MF strategy was development of practical and readily available methods within laboratories with basic setups of soft-lithography and biology. For the 3D ??MF strategy, a facile and biocompatible method was proposed and developed to mainly fabricate thin hydrogel sheets with microarchitectures. Hydrogel precursor solution, either along or combined with cells, could be coated as a thin film on the hydrophilic PDMS master, and the thin film could be crosslinked and gelled without morphological distortions through unique crosslinking process with nebulized aerosol of aqueous gelling agent, without sandwich micromolding process. The thin film could be exfoliated from the master as free-standing sheets, which could be free-standing cultured, harvested and assembled as a biofabrication unit to generate 3D cellular composites with controlled microscale structures.
The newly proposed bottom-up tissue engineering methodologies of 3D FF and 3D ??MF in this dissertation are now technically ready-to-use for tissue engineering research and will provide unprecedented tools for 3D tissue engineering.
본 학위논문은 세포 및 수화젤을 이용한 3차원 조직공학의 미세환경 제어에 관한 연구내용을 논하였다. 조직공학은 생체조직의 기능회복을 목표로 하며, 이 생체조직 기능회복을 위해서는 조직의 3차원 환경을 재건하는 것이 매우 중요하다. 3차원 조직공학의 기존 기술에는 세포 응집체, 솔리드 스캐폴드, 젤 스캐폴드를 사용하는 방식이 있으나, 이들 방식은 세포외기질을 포함한 3차원 미세환경을 제어하는데 크게 제약이 있었다. 이와 같은 제약점을 극복하기 위한 접근방법으로써 최근 bottom-up 조직 공학 기술이 제안되었다. 세포 혹은 세포를 포함하는 미세 세포단위체를 제작 및 조립하여 미세환경이 제어된 3차원 조직을 만들고자 하는 접근 방법이다.
전반부에는 bottom-up 조직 공학의 새로운 기술로써, 3차원 세포-수화젤 프린터 기술을 이용한 3차원 바이오인공조직의 제작 기술을 제안하였다. 3차원 바이오 프린터 로봇을 이용하여, 세포 및 수화젤을 미세방울 단위로 원하는 3차원 위치에 프린팅하고 적층하는 기술로써, 제작하고자 하는 임의의 3차원 세포패터닝을 가능케 할 수 있는 기술이다. 이 기술을 이용해 생체 피부조직의 진피층과 표피층을 모사한 진피세포 및 표피세포의 멀티레이어 구조를 콜라젠 수화젤 스캐폴드와 함께 프린팅하여 배양한 결과를 보고하였다. 이 기술을 발전시켜 콜라젠 수화젤 스캐폴드의 내부에 3차원의 신경세포 패터닝 및 배양 결과를 보고하여 임의의 3차원 세포패터닝이 가능함을 보고하였다. 이와 같은 세포배양 3차원 콜라젠 스캐폴드 내부로 영양분 및 산소를 원활히 공급하기 위해서 유체 관류가 가능한 수화젤 스캐폴드를 프린팅하는 기술 또한 제안하였다. 콜라젠 스캐폴드 프린팅시 스캐폴드 내부에 젤라틴 구조물을 프린팅하여, 스캐폴드 제작 이후 젤라틴 구조물을 선택적으로 제거하는 방식이다. 이를 이용해 영양분 및 산소의 확산 제약에 의해 발생하는 스캐폴드 내부 세포 괴사를 개선할 수 있었다.
이와 같이 3차원 세포-수화젤 바이오프린팅 기술을 이용하여 bottom-up 조직 공학에의 새로운 가능성을 제시하였으나, 이와 같은 기술은 3차원 바이오프린터와 같은 특수한 장비가 있어야만 구현이 가능한 기술이라는 제약이 있었다. 이와 같은 제약을 극복하기 위해, 소프트리소그래피 기술과 기본적인 생물학 실험실의 도구만으로 활용이 가능한, 조직 공학용 세포-수화젤 시트의 제작 및 조립에 관한 새로운 기술을 제안하였다.
친수성 PDMS 표면을 활용하여 세포-수화젤 용액을 150-200 ??m 정도로 얇게 코팅하고 이를 젤화 시킬 수 있는 물질을 미세 에어로졸 형태로 분무하여 굳힌 후, 형성된 세포-수화젤 시트를 PDMS 표면으로부터 떼어내는 간편한 프로토콜이다. 본 연구에서는 알지네이트 수화젤과 염화칼슘을 이용해서 이 방법의 활용 가능성을 확인하였다. 제작된 세포-수화젤 시트는 PDMS 표면의 3차원 미세패턴을 왜곡없이 잘 복제낼 수 있었으며, 본 연구에서는 최소 40 ??m 패턴까지 복제가능함을 확인하였고, 시트의 두께는 최소 50 ??m 까지 제작이 가능함을 실험적으로 확인하였다.
이를 이용해 마이크로헥사 시트, 벌집모양 시트, 마이크로헥사 메쉬, 마이크로홀 시트, 마이크로핑거 시트 등 다양한 형태의 시트가 제작 가능함을 확인하였고, 동일한 방법을 활용하여 마이크로헥사 모듈이나 2 mm 두께의 두꺼운 수화젤 구조 또한 형상 왜곡없이 제작 가능함을 확인하였다. 추가적으로 이와 같은 시트 구조내에 세포 어레이, 멀티플 세포 패터닝 등의 다양한 세포 패터닝 기술 또한 제안하여 이 세포-수화젤 시트의 응용가능성을 높였다. 제안된 시트 제작 기술은 매우 간편하였고, 제작된 세포-수화젤 시트는 용액 내에서는 역학적으로 안정하였고, 높은 내부 세포 생존율을 보였으며, free-standing 배양이 가능하였다. 또한 세포-수화젤 시트의 free-standing 배양은 일주일 정도까지 안정적이었으며, 이 배양 기간동안 언제든 필요한 시기에 옮겨서 추가적인 실험을 수행할 수 있었다.
확보된 시트 제작 기술을 활용하여, 제어된 3차원 미세환경 구조가 세포 배양 환경에 미치는 영향을 조사하는 연구를 수행하였다. 미세환경이 없는 시트와 마이크로헥사 시트에 HepG2 간세포를 배양하며 알부민 분비를 조사해 본 경과, 종래의 2차원 환경상에 배양된 HepG2 와 비교하여 시트 내부에 배양된 HepG2세포에서 높은 알부민 분비를 확인할 수 있었다. 또한 흥미롭게도, 미세환경이 없는 평면 시트와 비교하여 마이크로헥사 시트에 배양된 HepG2 세포의 경우 통계적으로 유의미하게 높은 알부민 분비를 보여주었다. 이를 통해 본 연구의 세포-수화젤 시트는 세포의 기능향상을 유도할 수 있는 배양단위로써 그 가능성을 확인할 수 있었으며, 또한 3차원 미세환경 구조가 세포 배양 환경에 미치는 영향을 조사해볼 수 있는 도구로써 활용될 가능성 또한 확인하였다.
세포-수화젤 시트의 제작 및 배양에 관한 기본적인 기술이 확보된 이후, 제작된 세포-수화젤 시트의 bottom-up 조직공학에의 적용가능성을 확인하기 위하여 세포-수화젤 시트의 조립 기술을 제안하였다. 3차원 미세환경이 제어된 세포-수화젤 시트를 적층하는 조립기술로 필터페이퍼와 같은 지지용 멤브레인을 활용하여 시트를 원하는 위치에 트랜스퍼하여 조립할 수도 있었고, 시트의 너비와 같은 치수를 가지는 지그를 활용하여 여러장의 세포-수화젤 시트를 얼라인먼트하여 간편하게 적층할 수도 있었다.
이와 같은 세포-수화젤 시트 조립 기술에 있어서 바닥면과 시트간의 결합, 시트와 시트간의 결합을 해결하는 점이 매우 중요하였다. 조립과정 동안 시트를 바닥면에 임시로 결합시키기 위해서는 젤라틴을 바닥면에 코팅하여 활용하였고, 시트를 배양기간 동안 안정적으로 바닥면에 결합시키기 위해서는 홍합 접착단백질을 바닥면에 코팅하여 활용하였다. 시트와 시트간의 결합을 위해서는 수화젤 표면을 일부 졸(sol)화 하였다가 다시 젤(gel)을 형성하는 식으로 결합시킬 수 있었고, 굳이 이와 같은 결합이 필요하지 않은 경우에는, 적층된 세포-수화젤 시트 가장자리에 졸(sol)상태의 수화젤을 미량 첨가하여 젤을 형성하는 방식으로 간편하게 여러층의 시트를 조립할 수 있었다.
이와 같은 조립기술을 이용하여 HepG2가 배양된 간시트의 적층 및 조립이 가능한 것을 실험적으로 확인하였으며, 이 과정이 세포 생존율 등에 영향을 미치지 않고, 조립 이후에도 배양이 가능함을 확인하였다. 하지만 150~200 ??m 두께의 시트가 3장 이상 결합된 경우, 확산 제약에 의해 내부 세포 괴사가 발생하는 한계점을 확인하였다. 이와 같은 한계점을 극복하기 위해 바이오프린터 연구에서 보고하였던 세포배양액 관류가 가능한 유체채널 도입이나, 기존 연구들에서 보고되었던 미세유체채널 집적형 수화젤과 같은 방법을 적용할 수 있을 것이다.
