Quantifying the concentration and purity of a target protein is essential for high-throughput protein expres-sion test and rapid screening of highly soluble proteins. However, conventional methods such as PAGE and dot blot assay generally involve multiple time-consuming tasks requiring hours or do not allow instant quanti-fication. Here, we demonstrate a new method based on the Photoactive yellow protein turn Off/On Label (POOL) system that can instantly quantify the concentration and purity of a target protein. The main idea of POOL is to use Photoactive Yellow Protein (PYP), or its miniaturized version, as a fusion partner of the target protein. The characteristic blue light absorption and the consequent yellow color of PYP is absent when ini-tially expressed without its chromophore, but can be turned on by binding its chromophore, p-coumaric acid. The appearance of yellow color upon adding a precursor of chromophore to the co-expressed PYP can be used to check the expression amount of the target protein via visual inspection within a few seconds as well as to quantify its concentration and purity with the aid of a spectrometer within a few minutes. The concentrations measured by the POOL method, which usually takes a few minutes, show an excellent correlation with those by the BCA Kit, which usually takes ~1 hour. We demonstrate the applicability of POOL in E. coli, insect, and mammalian cells, and for high-throughput protein expression screening.
The study of structural transition dynamics of proteins is essential for understanding the structure-function relationship. Pump-probe time-resolved X-ray solution scattering with nanosecond or picosecond time resolu-tion is used for studying the transition intermediates of some of the interesting protein such as hemoglobin, myoglobin. This method enables us to overcome the disadvantage prevailing in other time-resolved spectro-scopic techniques and provides real-time three-dimensional structural information of the transition intermedi-ates in a biochemical reaction process in solution. In the solution X-ray scattering, the scattering pattern repre-sents an average of the molecules in all possible orientations and hence is smooth one-dimensional curve like sine functions. The three-dimensional structural information pertaining to the macromolecule in such orienta-tion averaged scattering pattern is mostly reduced. The structural information extracted from the solution X-ray scattering data is of low quality in terms of reliability and accuracy. In order to overcome this problem, experimental investigations were conducted on heavy atom labeling of protein molecules. With the knowledge of the heavy atom position in the protein we can estimate scattering pattern of heavy atom labeled protein molecule. The heavy atom labeled to the protein molecule enriches the scattering pattern with more structural information thus increasing its reliability and accuracy. However, our observations showed that intense X-ray pulse causes the heavy atom to dissociate from the protein molecules. We have screened and modified the existing labeling methods to devise a novel method for heavy atom labeling that can endure intense X-ray pulse. A slightly lower atomic weight heavy atom, X-rays with shorter wavelength and weak intensity and a bigger conjugate linker increased the ability of the heavy atom to remain bound to the protein during the experiment. One can obtain scattering signal from pump-probe X-ray solution scattering by attaching heavy atoms to various position’s using this novel heavy atom labeling method. From the heavy atom enriched scattering pattern we can acquire the structural information of the reaction intermediates with higher accuracy and reliability. Thus this method can dramatically help us to elucidate protein reaction mechanism.
단백질의 구조 또는 특성에 대해서 연구하려면 흔히 많은 양의 물에 용해성이 있는 단백질이 필요하다. 이런 많은 양의 단백질을 얻기 위해서 대장균이나 곤충세포 혹은 포유동물 세포 같은 특정 셀에 과량 발현시켜서 재조합 단백질을 만들어서 분리하는데 이때 cell 에서 대상 단백질이 어느 정도 발현되고 용해성 있는 형태로 되는지 확인하는 것은 필수불가결한 단계이다. 일반적으로는 재조합 단백질의 발현양과 그 순도를 알기 위해서 PAGE gel을 이용한다. 또 high throughput 단백질 발현 스크리닝을 위해서 dot blot이라는 immunodetection방법이 제시되었다. 그러나 위의 두 방법은 시간이 많이 걸리는 일이거나 아니면 대상 단백질의 양이나 순도을 정확히 알 수 없는 단점이 있다. 우리는 mini-Photoactive yellow protein based turn On/Off Label (POOL) 방식을 이용하여 빠르고 정확하게 그리고 한 번의 방법으로 대상 단백질의 발현을 알 수 있고 간편하게 정량 및 순도를 테스트 할 수 있는 방법을 제시한다. 우리는 POOL을 사용하면 chromophore 첨가 만으로 단백질의 발현 유무와 정량이 가능한 것을 발견하였고 이것은 대장균뿐만 아니라 곤충세포, 포유동물 세포의 단백질 발현 시스템에서도 동일하게 적용된다는 것을 발견하였다. 또한 단백질을 분리 시 오로지 색을 보고 대상 단백질이 있는을 선택할 수 있어서 빠르게 순수분리 할 수 있게 도와준다는 것을 발견하였다. 더 나아가서 이 방법을 이용하면 high throughput 단백질 발현 스크리닝시 많은 수의 샘플에 대한 단백질 발현 량, 순도 등을 아주 간단하게 확인 할 수 있다는 것을 발견하였다. 가장 큰 장점은 다른 tag system하고 상보적으로 같이 써도 아무런 문제가 없다는 것이다. 우리의 결과는 POOL이 단백질 발현 테스트와 순수분리을 쉽게 하게 해주고 게다가 High throughput protein expres-sion and purity screening도 더욱 간편히 해준다는 것을 증명하였다. POOL 방법이 단백질 연구를 위한 단백질 준비에 앞으로 많이 도움이 될 것이라고 기대한다.
단백질 구조동역학의 연구는 구조와 기능의 관계를 이해하기 위해서 필수적이다. 최근에 나노초 또는 피코초 펌프/프로브 X-ray 용액상 산란단백질의 중간체 연구를 위해서 개발 되었고 헤모글로빈이나 마이오글로빈등에 적용되었다. 이 방법은 기존 time-resolved spectroscopy 단점을 극복하여 용액상에서의 효소반응 과정에서 중간체의 3차원 구조를 실시간으로 관측할 수 있는 방법으로 용액상에서 단백질의 반응이 일어날 때 나타나는 구조변화를 연구할 수 있다. 그러나 용액에서의 산란 패턴은 sine함수의 부드러운 곡선형으로 나오기 때문에, 단백질 중간체의 3차원 구조 해석에 대한 정보의 수가 더 적게 되어서 해석의 신뢰도와 정확성이 떨어진다. 이 문제를 해결 하기 위해서 현재 heavy atom 라벨링 책략이 시도되고 있다. 단백질의 어느 위치에 heavy atom을 표지 했는지 알고 있으므로 계산적인 방법으로 커브의 변화를 예측 할 수 있고 이러한 예측과 측정된 신호를 비교하여 대상 단백질의 구조변화에 대한 정보를 알 수 있다. 그러나 강한 X-선 펄스에는 heavy atom 단백질의 본드가 끊어지기 쉽다. 우리는 기존 방법과 그 응용방법으로 강한 X-선 펄스에도 단백질에 heavy atom이 계속 라벨링 될 수 있는 방법을 찾았다. 좀 더 낮은 원자번호와 더 짧은 파장의 X-선과 좀 더 약한 강도의 X-선, 더 많은 conjugate가 필요조건이다. 이와 같은 heavy atom 라벨링을 통해서 시간분해 엑스선 회절 방법으로 다양한 신호를 얻을 수 있으며 그 정보를 바탕으로 보다 정확도 높은 단백질 구조변화 및 중간체의 구조 정보를 알 수 있어서 단백질의 반응 메커니즘을 규명하는 데 획기적인 도움이 될 것이다.
