Apocynin is a well-known chemical inhibitor of NADPH oxidase which is enzyme complex generating reactive oxygen species (ROS), specifically phagocytic NADPH oxidase (PHOX or NOX2). Given the pro-inflammatory effects of ROS, apocynin has been studied for its use as a therapeutic agent in various disease models. While the effects of apocynin on neutrophils and monocytes have been investigated, it remains to be elucidated whether apocynin modulates the effector function of T cells even though T cells also express functional phagocytic NADPH oxidase. Thus, in the present study we examined the effect of apocynin upon, and investigated its mechanism of action in, T cells.
We found that apocynin directly inhibited the production of cytokines such as TNF-α, IFN-γ, and IL-2 in anti-CD3/anti-CD28-stimulated CD8+ and CD4+ T cells. We then attempted to delineate the mechanism of action of apocynin specifically in CD8+ T cells. To this end, electrophoretic mobility shift assays revealed that apocynin attenuates anti-CD3/anti-CD28-induced NF-κB activation in CD8+ T cells. TNF-α mRNA transcription induced by anti-CD3/anti-CD28-stimulation also inhibited by apocynin treatment. Interestingly, the inhibitory effect of apocynin on TNF-α production by CD8+ T cells was also observed in CD8+ T cells from NOX2-deficient mice, suggesting that apocynin acts in a NOX2-independent manner. Apocynin could not inhibit the production of TNF-α from CD8+ T cells stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin suggesting that the action is upstream of protein kinase C.
We also systematically studied NOX2-dependency of apocynin in CD8+ T cells by gene expression profiling studies and demonstrated that gene regulation in response to apocynin can occur via both NOX2-independent and -dependent mechanism. In functional annotation clustering of genes, cytokine activity-related genes were significantly enriched among NOX2-independently downregulated genes by apocynin treatment. Among NOX2-independently upregulated genes by apocynin, genes related with chromatin structure were significantly enriched, implying unknown action mechanism of apocynin, which is worth to be investigated in future study.
Taken together, we demonstrated that TNF-α production by CD8+ T cells is inhibited by apocynin in a NOX2-independent manner. CD8+ and CD4+ T lymphocytes have important roles in many disease models in which apocynin showed beneficial effects. So our finding of the apocynin action on T lymphocytes has critical implications on the interpretation of apocynin study. Recently, apocynin has been used in clinical studies for the treatment of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. As shown in the present study, the effect of apocynin on T cells also needs to be considered for future clinical applications.
Apocynin은 활성산소(ROS)를 생성하는 NADPH oxidase의 억제제로 여러 연구에 널리 사용되고 있다. 특히 PHOX 혹은 NOX2로 알려진, 대식세포에서 주로 발현하는 NADPH oxidase의 억제제로 많이 알려져 있다. 활성산소가 염증과 조직 손상을 유발하는 중요한 물질이므로, 여러 질병 모델에서 apocynin을 치료제로 사용하려는 연구들이 행해졌다. 현재까지 Apocynin의 효과에 대해서 다양한 세포들을 대상으로 연구가 되었지만 면역세포에서는 대부분의 연구가 NOX2를 주로 발현하고 있는 호중구나 단핵구, 대식세포들을 대상으로 행해졌다. T 세포도 NOX2를 발현하고 있음이 알려졌으나 아직까지 apocynin이 T 세포에 미치는 영향에 대해서는 거의 연구가 되어있지 않은 상태이다. 본 연구에서는 apocynin이 T 세포에 미치는 영향과 그에 대한 기전을 알아보았다.
본 연구를 통해 apocynin이 anti-CD3/anti-CD28 자극을 받은 CD8+ T 세포나 CD4+ T 세포에서 분비되는 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IFN-γ, IL-2를 억제하는 효과가 있다는 것을 확인하였다. 다음으로 가장 효과가 두드러졌던 CD8+ T 세포의 TNF-α 생성에 초점을 맞추어서 apocynin의 작용기전에 대해서 좀 더 자세히 알아보았다. CD8+ T 세포에anti-CD3/anti-CD28 자극을 주고 유도되는 TNF-α의 전령RNA(mRNA)의 발현 정도를 보았더니 apocynin을 처리하면 전령RNA의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. T 세포에서 TNF-α 전사에 중요한 전사인자인 NF-κB의 활성도를 EMSA(electrophoretic mobility shift assay)를 통해 측정해 본 결과 apocynin을 처리하면 anti-CD3/anti-CD28 자극에 의한 CD8+ T 세포의 NF-κB 활성도가 감소한다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 흥미롭게도 이러한 효과는 NOX2-결핍 마우스의 CD8+ T 세포에서도 관찰되는 것을 확인하여서, 상기의 효과는 NOX2 억제와는 무관한 기전으로 일어난다는 것을 확인하였다. CD8+ T 세포를phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 와 ionomycin으로 자극했을 시에는 apocynin의 억제효과가 나타나지 않는 것으로 보아 apocynin의 작용은 protein kinase C의 상위 레벨인 것으로 생각된다.
Apocynin의 작용에 있어 NOX2에 대한 의존도를 좀 더 체계적으로 확인하기 위해 microarray를 통한 분석을 시도하였다. 유전자의 발현 프로파일링을 살펴 본 결과 apocynin은 NOX2-의존적인 작용과 NOX2-독립적인 작용을 함께 한다는 사실을 확인할 수 있었다. Functional annotation clustering을 통해서 NOX2-독립적으로 apocynin에 의해 발현이 감소하는 유전자들을 살펴본 결과 사이토카인과 관련된 유전자들이 의미있게 많이 모여있어서 본 연구결과와 일맥상통하는 결과를 보여주었다. NOX2-독립적으로 apocynin에 의해 발현이 증가하는 유전자들은 염색질(chromatin)의 구조와 관련된 유전자들이 상당한 통계적 유의성을 가지며 모여있었다. Apocynin이 염색질의 구조에 미치는 영향에 대해서는 아직 연구된 바가 없으므로 향후 이에 대해 연구해 볼 가치가 있을 것이다.
본 연구를 통해서 apocynin이 CD8+ T 세포에 직접적으로 작용하여 TNF-α 사이토카인의 생성을 억제하는 효과가 있다는 것을 확인하였으며, 특히 이러한 효과가 기존에 알려져 있던 apocynin의 작용기전인 NOX2의 억제와는 관련이 없다는 사실을 확인하였다. 현재 apocynin은 여러 질병모델에서 유망한 치료제로써 연구가 되고 있는 실정이며 치료효과를 대부분 T 세포 이외의 다른 세포에서 발현하고 있는 NADPH oxidase의 억제를 통해서 나타나는 것으로 설명하고 있다. 하지만 apocynin이 사용되고 있는 다양한 질병모델에서 T 세포 또한 아주 중요한 역할을 하고 있고, 이러한 관점에서 본 연구 결과는 이제까지의 apocynin의 치료효과에 대한 해석에 중요한 시사점을 제공한다고 하겠다. 최근에는 apocynin이 천식과 만성 폐쇄성 폐질환에 치료제로써 임상 1상 연구가 시행되었고 긍정적인 결과를 얻었다. 본 연구에서 확인한 apocynin의 T 세포에 대한 영향을 고려할 때 apocynin의 새로운 임상 적응증도 고려할 필요가 있겠다.
