A cell-based quantitative assay system for Hcy, utilizing two Escherichia coli auxotrophs that are genetically engineered to grow in the presence of methionine (Met) and either homocysteine (Hcy) or Met, has been developed. A bioluminescent reporter gene, which produces luminescence as cells grow, was inserted into the auxotrophs, so that cell growth can be readily determined. By measuring relative luminescence unit (RLU) values from the two auxotrophs immobilized within agarose gels arrayed on a well plate, the amount of Hcy is quantitatively determined based on differences between two RLU values corresponding to cell growth of two auxotrophs with excellent levels of precision and reproducibility. Finally, the diagnostic utility of this assay system was verified by its employment in reliably determining different stages of hyperhomocysteinemia in human plasma samples. In contrast to existing conventional methods, the new system developed in this effort is simple, rapid and cost effective. As a result, it has great potential to serve as a viable alternative for Hcy quantification in the diagnosis of hyperhomocysteinemia.
We have developed a new cell-based galactose assay utilizing two bioluminescent Escherichia coli immobilized within agarose gel arrayed on a well plate. galT knockout strain (galT(-) cell) was genetically engineered to inhibit the cell growth in the presence of galactose in a sample, thus its growth was proportional to glucose concentration. On the other hand, E. coli W (normal cell), which is original strain before the genetic engineering to obtain galT(-) cell, normally grew in the presence of either galactose or glucose. Into the two E. coli strains, a bioluminescent reporter gene which produces luminescence as cells grow was transformed for facile measurement of the cell growth. Therefore, a relative luminescence unit (RLU) value corresponding to the galT(-) cell growth induced by glucose was subtracted from the RLU value corresponding to the normal cell growth induced by both glucose and galactose. From the differences of RLU values, we successfully determined galactose concentrations from multiple clinical blood spots of newborn babies. Based on the verification for the diagnostic utility of our method, we suggest that the cell-based solid-phase galactose assay is a powerful alternative for more rapid, convenient, and cost-effective diagnosis of galactosemia in newborn screening as compared to conventional assays which require labor-intensive and time-consuming procedures or complicated and expensive equipment.
Leucine auxotroph displaying GBP (gold binding protein) has been used to develop whole-cell SPR (surface plasmon resonance) sensor for the diagnosis of maple syrup urine disease. Leucine auxotroph was genetically engineered to grow in the presence of target amino acid leucine, thus its growth was proportional to leucine concentration. Due to pTac-FadLGBP-1 plasmid transformed to the cells, the grown cells by leucine in a test sample displayed GBP on their surface, and they were simply and directly bound to the gold surface of the SPR chip without any additional treatment or reagent. Finally, the SPR signals generated by the attached cells were obtained to determine leucine levels of the test samples based on cut-off value for leucine in maple syrup urine disease. To more enhance the signals, we further used gold nanoparticles (GNPs) which have a property of specific binding to GBP on the cell surface. By applying GNPs after binding of the cells on the SPR chip, the signals were significantly enhanced up to 10 times. Finally the diagnostic utility of our system was verified by its employment in reliably determining different states of maple syrup urine disease in real clinical samples. Our experimental results reported here open up a new possibility of easy, rapid, and reliable diagnosis of maple syrup urine disease by moni-toring SPR signals. Moreover, this new approach using leucine auxotroph displaying GBP to SPR sensor provides a great potential to be extended to newborn screening for the diagnosis of homocystinuria and phenylketonuria which are also related with abnormal amino acid levels.
아미노산의 일종인 메치오닌 (Methionine)에만 의존하여 성장하는 영양요구주와 메치오닌과 호모시스테인 (Homocysteine) 모두에 의존하여 성장하는 영양요구주를 각각 유전자 조작법을 통해 만들었다. 그 후 각각의 균주 속에 생물발광 (bioluminescence)을 유도할 수 있는 표지유전자를 주입함으로써 두 균주의 성장차이를 생물발광 신호차이로 인식하여 호모시스테인을 정량하는 기술을 개발하였다. 또한 이 두 균주를 아가로스 (agarose) 용액과 혼합된 고형 상태로 96-홈판 (96-well plate)에 배열하고 각각의 홈에 혈액 샘플을 넣어서 4시간 가량 배양한 후 발광신호를 측정함으로써 심혈관 질환의 핵심 마커인 호모시스테인 농도를 간편하고 빠르게 분석하는 시스템을 구현하였다. 결과적으로, 실제 사람의 혈액 속에 존재하는 호모시스테인을 매우 높은 정확도와 재현성으로 정량함으로써 심혈관질환을 진단하는 데에 본 기술이 유용하게 쓰일 수 있음을 입증하였다. 이 기술은 기존의 호모시스테인 정량 분석에 많이 사용되고 있는 효소반응 또는 고성능 액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography)를 이용한 방법이 갖고 있는 비교적 긴 시간과 고비용을 소모하는 단점을 극복하고, 아무런 추가 조작 없이 단순히 유전자 재조합 대장균을 배양하고 그에 따라 자동적으로 생성되는 발광신호를 측정함으로써 매우 신속 간편하게 호모시스테인 농도를 분석하는 방법이다. 뿐만 아니라, 많은 수의 혈액 샘플을 대량으로 동시에 분석할 수 있는 매우 경제적인 방법이기 때문에 최근 급성장하는 호모시스테인 정량검사 분야에 있어서 매우 큰 상업화 가능성을 가지고 있는 기술이다.
신생아 대사질환 중의 하나인 갈락토스혈증 (galactosemia)을 진단하기 위해 혈액 속 갈락토스 (galactose) 농도를 두 개의 서로 다른 생물발광 대장균의 성장차이로 분석하는 기술을 새롭게 개발하였다. 갈락토스 대사분해 과정 중에 필요한 효소를 합성하지 못하도록 유전자 재조합을 통해 galT 유전자가 삭제된 균주 (galT knockout strain)와 원래의 정상적인 균주에 각각 생물발광 표지유전자를 주입하였다. 그리고 오로지 글루코스 (glucose)에 의존하여 성장하는 galT knockout strain의 성질을 이용하여 샘플 속 글루코스를 정량하였고, 글루코스와 갈락토스에 모두 의존하여 성장하는 정상 균주로부터 얻은 발광신호에서 galT knockout strain으로부터 얻은 신호를 차감함으로써 갈락토스 농도를 측정할 수 있었다. 그리고 다수의 샘플을 한 번에 스크리닝 하기 위해 균주를 아가로스 (agarose) 용액과 혼합하여 고형 상태로 96-홈판 (96-well plate)에 배열하였고, 혈액 샘플을 홈판에 넣고 4시간 배양 후 발광신호를 읽음으로써 갈락토스를 보다 쉽고 빠르게 정량 할 수 있었다. 이 기술은 기존의 많은 노동을 요하고 시간과 비용이 많이 드는 갈락토스 분석법들을 대체할 수 있는 보다 경제적이고 간편한 분석법이며, 구체적인 상용화를 통해 신생아 대사질환 스크리닝에 매우 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
아미노산의 일종인 류신 (leucine)에만 의존하여 성장하는 영양요구성 대장균의 세포 표면에 금 부착 단백질 (gold binding protein)을 발현시킴으로써 표면이 금으로 이뤄진 SPR chip에 세포 자체가 스스로 부착되도록 만들었다. 그리고 샘플 속 류신을 먹고 자란 균주를 SPR 채널에 주입함으로써 곧바로 생성되는SPR 시그널을 모니터링 하여 류신의 농도를 간편하게 분석할 수 있는 시스템을 구현하였다. 작은 차이의 서로 다른 류신 농도에 의한 시그널들을 보다 쉽게 구분하기 위하여 균주를 주입한 후 골드 나노입자 (gold nanoparticles)를 한번 더 주입하였다. 이 골드 나노입자들은 SPR chip에 부착된 세포 표면에 추가적으로 부착됨으로써 10배 이상의 시그널 증폭 효과를 가져다 주었다. 이러한 신개념의 세포 기반 SPR 센서 시스템을 신생아 대사질환의 하나인 단풍당뇨증을 진단하는 데에 응용하였다. 신생아의 혈액 속 류신의 농도가 정상 기준보다 증가했을 경우 단풍당뇨증을 유발하는 것으로 알려져 있는데, 본 기술을 이용함으로써 실제 신생아 혈액 여지로부터 추출한 혈액 성분 속 류신의 농도를 정상 기준 이하 또는 이상의 농도까지 분석할 수 있었다. 이 기술은 단순히 균주를 배양하고 그에 따라 자동적으로 생성되는 금 부착 단백질로 인해 균주가 아무런 추가 조작 없이 곧바로 SPR chip에 부착되는 현상을 SPR 시그널로 읽음으로써 샘플 속 류신의 농도를 분석하는 신개념 분석법이다. 이 분석법은 기존의 신생아 대사질환 스크리닝에 많이 쓰이는 효소전환법이나 HPLC분석법이 갖는 고비용 소모, 노동집약적 절차 등의 단점을 극복한 보다 쉽고 간편한 방법이며, 이는 단풍당뇨증 뿐만 아니라 신생아 대사질환 중 비정상적인 아미노산 농도 증가에 기인하는 페닐케톤뇨증이나 호모시스틴뇨증을 진단하는 데에도 유용하게 쓰일 수 있다.
