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Effective manufacturing methods of various ginsenosides, including Rg3, Rh2 and studies on anti-cancer effects against various cancer cells using in vitro and in vivo tests = Rg3, Rh2 등을 포함한 다양한 Ginsenosides의 효율적 합성과 이들의 in vitro와 in vivo 실험을 통한 다양한 암세포에서의 항암효과 연구
서명 / 저자 Effective manufacturing methods of various ginsenosides, including Rg3, Rh2 and studies on anti-cancer effects against various cancer cells using in vitro and in vivo tests = Rg3, Rh2 등을 포함한 다양한 Ginsenosides의 효율적 합성과 이들의 in vitro와 in vivo 실험을 통한 다양한 암세포에서의 항암효과 연구 / Youl Her.
저자명 Her, Youl ; 허율
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2013].
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초록정보

Although the biological effects of various ginsenosides, such as Rb1, Rg3, Rh2, and compound-K, have been examined, there is almost no commercial product of single or combined ginsenosides that has been developed for limited therapeutic uses. This is because of the difficulty in preparing the main ingredient (i.e., dried ginseng composed of approximately 2% of the ginsenosides, from various species), and the insufficient efficacy of each ginsenoside. Despite the large number of studies that have been conducted on a variety of ginsenosides, sufficient phar-macological activity has not been demonstrated with a single ginsenoside. Thus, the approach described here may provide evidence of the efficacy of ginensoside-based medicines. Ginsenosides with protopanaxadiol and protopanaxatriol groups, ginseng or red ginseng, which have very low levels of Rg3 and Rh2 and various phar-macological activities, are desired for efficient mass production. This study confirms that ginsenosides have potential to be used as an anticancer substance through in vitro and in vivo test of various cancer cells, especially lung cancer cells. This study also reveals effective and creative mass-manufacturing methods of rare ginsenosides that show meaningful medicinal effects and sets up various methods of manufacturing, separation, refining and analyses of ginsenosides to verify anticancer effects. The study set up solvent systems and analyzing conditions which can analyze twenty-five standard samples of gin-senosides through minimum legibile HPLC at one time. The first step for mass production of effective ginseno-sides Rg3 and Rh2 was to extract and refine the ginsenosides mixtures (GM1) from ginseng, then Rb1(351 mg/g) and Rd(86mg/g) were verified among the ginsenosides forming the mixture. The second step was to obtain GM2 containing Rg3(241 mg/g) and Rh1(173 mg/g) after acid hydrolysis and the refinement of GM1. The third step was to obtain GM3 containing F1(161 mg/g) and F2(30.5 mg/g) after processing β-glycosidase from Asper-gillus Oryzae to GM1 and refining it. The effective production of F2 is very important for mass production of Rh2 for several reasons. The first reason is that even though it is possible to produce Rh2 from Rg3 in terms of molecular structure, it is not very practical. Secondly, in terms of structure, when sugar moieties are hydrolyzed, it is possible to produce both Rh2 and Compound-K. However, when it is acid hydrolyzed, most components are converted to Rh2(218 mg/g, from GM4). This has not been reported up to the present and is considered to result from the selectivity of the stereochemistry of ginsenoside structures. All ginsenosides produced from GM1, 2, 3 & 4 were separated through various solvent systems and silica columns and their components were verified using HLPC Chromato-grams. F1 and F2, which are ginsenosides produced from new manufacturing methods, were needed to verify its components through 1H-NMR and 13C-NMR. The basic study was carried out in order to select potential substances with medicinal value from among all the ginsenosides produced in this study, to be used for future study. Twenty-two ginsenosides and one ginseno-side mixture were selected through in vitro testing with lung cancer cells (NCI-H23). Four ginsenosides were selected from first screening and were rescreened with various cancer cells. Three po-tential substances, including two ginsenosides (Rg3 & Rh2) which were selected from second screening, and a 50/50 mixture of Rg3:Rh2 were chosen and used for in vivo tests (nude mice) with lung cancer cells (NCI-H23) to verify and compare anti-lung cancer effectiveness. The test results revealed that the mixture of Rg3:Rh3 showed better anti-lung cancer efficacy when compared to the Rg3 or the Rh2 components singularly. This test result confirms that each ginsenoside has different anti-lung cancer mechanisms and creates a synergistic effect. In order to find more effective substances of ginsenoside composites, ginsenoside mixtures (H-2) with accu-rate ginsenoside weight% ratios, having the mixture of one part ginsenosides (Rg3 & Rh2, selected from second screening) and one part ginsenosides (Rb1, Rg1 etc. selected from the published research papers related to im-munomodulating activity) were tested in vitro against various cancer cells including lung cancer cells (NCI-H23). However, meaningful anti-cancer effects showing GI50 (8.562-13.778 ug/ml) were not verified. Out of three in vitro test results performed as above, generally, they did not show anti-cancer effects com-pared to in vivo tests. The reason for the result could be attributed to administration methods and whether it is processed through metabolism (in vivo) or not (in vitro), as well as interaction between various factors of gin-senosides in the body, which is because of a general phenomenon happening to glycosides as medicinal sub-stances. In association with the above mentioned prospective result, it was confirmed again that H-2 has anti cancer effects against lung cancer cells(NCI-H23) through in vivo (nude mice) tests. According to the test results on the final date, it was revealed that the H-2 group showed more meaningful anti-cancer effects, suppressing both size and weight of cancers compared to a solvent group statistically, 88.5% ( p<0.001 ) and 86.9% (p<0.001) . The H-2 composed of ginsenosides, Rb1, Rg1, Rd, Rg3, Rh1, Rh2, PPT has shown better anti-cancer effects against lung cancer cells(NCI-H23) compared to single component of Rg3, Rh2 or the mixture, Rg3:Rh2(50:50). How-ever, the dose of H-2 did not show any relationship with increasing efficacy. Anti lung cancer effects with a dose of 10 mg/kg were not higher than that of 1 mg/kg and 3 mg/kg. This result of dose-independence was confirmed again after repeating the same test, but additional research regarding drug delivery systems and metabolism will be necessary to draw better conclusions. The meaningful lung cancer suppression effects of H-2 motivated research on cancer metastasizing activity. During the thirteen day test period, one group was dosed daily with H-2 via abdominal injection while the other group was dosed with H-2 orally. On the last day, every body was inspected post autopsy and the pulmonary tumor colonies were counted visually. The group administered by abdominal injection with H-2 (1 mg/kg) showed statically meaningful results, 49.3% (p0.01). In the group administered H-2 orally, activation could not be verified. It is considered that ginsenoside sugar is hydrolyzed by gastric acid and enteric bacteria when ad-ministered orally, however, with abdominal injection, sugar hydrolysis happens rarely and the drug is delivered to the targeted place and resulting in cancer suppression, where as metabolites of ginsenosides have disad-vantages in terms of drug delivery systems. Even though the anti-lung cancer effects of the H-2 mixture of ginsenosides have been confirmed, additional in vivo (nude mice) tests against several other cancer cells were performed. Colorectal cancer cells(SW620), kid-ney cancer cells(ACHN) and breast cancer cells(MDA-MB-231) were transplanted to nude mice and the anti-cancer effects of H-2 were evaluated. However, any meaningful anti-cancer effects have not been verified from the tested cancer cell groups. In conclusion, various ginsenosides were produced effectively through a specific process of hydrolysis of sug-ar moieties including enzyme reaction and accordingly, effective and creative methods of separation, refining and analysis of ginsenosides have been suggested in this study. Also, specific ginsenosides have anti lung cancer effects and suppressive effects on metastatic cancer. In particular, a certain mixture of ginsenosides (H-2) has shown better effects compared to single component ginsenosides, and this study suggests very effective meth-ods for how to find the most appropriate mixture combinations. However, a specific mixture of ginsenosides (H-2) was not dose-dependent and superior results at specific doses were questionable. This result was reported as a idiosyncratic drug reaction (IDRs), however, its origin has not been determined, yet. Also, the mixture of ginseno-sides (H-2) has shown better suppression effects of metastatic cancer when it was administered by injection ra-ther than by oral administration, which was attributed to the disadvantage of the drug delivery system when it was administered orally because of the metabolism of ginsenosides in the body. Finally, specific ginsenosides including the mixture H-2 have shown more anti-cancer efficacy against various cancer cells, particularly, lung cancer cells at lower doses. Additional research on high doses for other cancer cells will be necessary. However, low doses will remain essential as potential substances for anti-cancer drug. Hence, it is believed that the mixture H-2 has high potentiality as an anti-lung cancer drug.

본 논문에서는 폐암세포를 중심으로 한 다양한 암세포를 대상으로 하여 항암제로서의 진세노사이드의 가능성을 in vitro, in vivo 실험을 통해 확인하였다. 또한 의미 있는 약리효능을 보여준 희귀 진세노사이드들의 효율적이고 독창적인 대량생산에 대해서도 보여주고 있으며, 항암효능을 확인하기 위해 필요한 실험 약물로서의 다양한 진세노사이드의 제조법, 분리, 정제법, 분석 방법 등을 정립하였다. 아울러, 25종의 진세노사이드 표준 시료를 HPLC를 이용해 높은 분리능으로 한번에 분석할 수 있는 이동상(solvent system)과 분석 조건들을 확립하였다. 궁극적으로 진세노사이드 Rg3와 Rh2를 효율적으로 대량 생산하기 위한 첫 번째 공정(step1)으로 인삼으로부터 Ginsenoside Mix-ture(GM1)을 추출, 정제 하였으며, 이를 형성하는 진세노사이드들에는 Rb1(351mg/g), Rd(86mg/g) 등이 확인되었다. 두 번째 공정(step2)으로 GM1을 산가수분해한 후 정제 하여 Rg3(241mg/g)와 Rh1(173mg/g)을 함유하는 GM2를 얻을 수 있었다. 세 번째 공정(step3)으로 GM1에 다시 효소(β-glycosidase from Aspergillus Oryzae)를 처리한 후 정재 하여 F1(161mg/g), F2(305mg/g)를 함유 하는 GM3를 얻을 수 있었다. F2의 효율적인 생산은 Rh2의 대량 생산을 위해 매우 중요하다. 그 첫째 이유는 분자구조적으로 Rg3로부터 Rh2를 제조할 수 있는 기회가 있다고 판단되나 사실은 매우 어렵기 때문이다. 둘째 이유는 구조적으로 F2의 당들(sugar moieties)을 가수분해 하면 Rh2와 Compound-K가 모두 생길 수 있는 기회가 있지만 F2를 산가수분해 하면 대부분이 Rh2(218mg/g, from GM4)로 전환된다. 이 결과는 지금까지 어떤 논문에서도 보고되지 않은 결과이며, 진세노사이드의 입체구조적 특성에서 오는 선택성이라 판단된다. GM1, 2, 3, 4에서 제조된 모든 진세노사이드들은 다양한 solvent systems으로 silica column을 통해 분리되어졌고 HPLC Chroma-tograms에 의해 성분 확인 되었다. 또한, F1, F2는 신규 방법으로서 제조된 진세노사이드로서 구조적 성분 확인이 필요하여 1H-NMR, 13C-NMR를 통해 확인 되었다. 본 연구에서 제조된 모든 진세노사이드들로부터 지속적으로 연구에 사용될 후보 약리 물질로서의 진세노사이드들을 선정하기 위해 기초 연구를 진행하였다. In vitro 실험을 통해 22가지의 단일 진세노사이드들과 1종의 진세노사이드 mixture가 폐암세포(NCI-H23)에서 선택적으로 screening 되어졌다. 진세노사이드들의 screening을 통해 1차로 선정 된 4종의 진세노사이드들을 폐암세포를 포함한 다양한 암세포군에서 재차 screening(진세노사이드들과 암세포들의 screening)되었다. 2차로 선정된 2종(Rg3, Rh2)의 진세노사이드들 각각과 Rg3:Rh2, 50:50(질량 비율) 혼합물로 하는 3종의 후보 물질들을 선정하여 폐암세포(NCI-H23)에서 in-vivo(nude mice)실험을 통해 그들의 폐암억제 효과를 확인, 비교함으로써, Rg3 or Rh2 단일 성분 보다는 Rg3:Rh2 혼합물의 경우에 더 좋은 항폐암효과를 보여줌을 확인할 수 있었다. 이 결과는 각각의 진세노사이드가 다른 항폐암 메커니즘을 통해 시너지 효과를 나타낸 것으로 판단할 수 있다. 더 높은 활성을 갖는 진세노사이드 혼합조성물의 발굴을 위해, 2차로 선정 된 2종(Rg3, Rh2)의 진세노사이드들과 기존 연구자들에 의해 발표 되어진 진세노사이드의 Immunomodulating activity관련 논문들을 통해 선택된 Rb1, Rg1 등을 포함하는 정확한 비율의 ginsenoside mixture(H-2)가 폐암세포(NCI-H23)를 포함한 다양한 암세포에서 in vitro 실험 되어졌지만, GI50(8.562-13.778 μg/ml)를 통한 의미 있는 항암효과는 확인되지 않았다. 본 연구를 포함해 위 3차례의 in vitro 실험의 결과를 보면, 보편적으로 in vivo 실험의 결과에 비해 의미 있는 항암효과를 보여주지 못했다. 이 결과는 진세노사이드의 투여 방법에서 그 이유를 찾을 수 있으며, 메타볼리즘 Process(in vivo)를 거치는가 아닌가(in vitro)에 따른 다양한 metabolites로서의 진세노사이드와 체내에서의 다양한 요소들(factors) 간의 상호작용(interactions)에 기인한 결과라 추정된다. 이와 같은 결과는 약물로서의 다양한 glycosides들에서 보편적으로 나타나는 현상들이다. 위에서 언급된 희망적인 결과에 기인해, H-2는 폐암세포(NCI-H23)에서 in vivo (nude mice)실험을 통해 그들의 폐암억제효과가 다시 확인되었다. 실험 최종일 결과를 보면 H-2처리군은 용매대조군에 비해서 88.5% (p<0.001)의 통계적으로 유의성 있는 암세포 크기의 억제효과가 관찰되었으며, 86.9% (p<0.001)의 통계적으로 유의성 있는 종양무게의 감소가 나타났다. 진세노사이드 Rb1, Rg1, Rd, Rg3, Rh1, Rh2, PPT으로 형성된 H-2는 폐암세포(NCI-H23)에서 각 단일 진세노사이드 Rg3, Rh2나 혼합물 Rg3:Rh2(50:50)에 비해 더 나은 항폐암효과를 보여주었다. 한편, H-2의 처리량에 따른 효능 결과가 비례하지 않았으며, 10mg/kg에서의 항폐암효과가 1mg/kg, 3mg/kg에서 보다 높지 않았다. 이 농도비의존적(dose-independent)결과는 추가적인 동일 연구를 통해 재차 확인 되어졌으며, 약물전달 및 약물대사의 추가 연구가 필요하다 판단된다. H-2의 의미 있는 폐암억제 효과는 암전이억제 활성연구를 진행하게 하는 중요한 동기가 되었다. 13일 동안 H-2를 복강주사군과 경구투여군으로 나눠 매일 투여한 후 최종일 부검하여 육안으로 pulmonary tumor colony수를 계수하였다. H-2를 1mg/kg씩 복강투여한 군에서 49.3%(p<0.01)로서 통계학적으로 유의성 있는 결과를 주었지만 경구투여군에서는 활성을 확인할 수 없었다. 그 이유로H-2는 경구투여시 위산과 장내미생물에 의해 진세노사이드들의 당들이 분리되는 가수분해가 일어나지만 복강투여시에는 당들의 가수분해가 적어 비교적 온전히 필요한 곳에 약물이 전달되어 암전이를 억제하는 것으로 판단되며, 진세노사이드들이 대사 되어진 대사체들은 drug delivery를 불리하게 하는 이유인 것으로 판단된다. 진세노사이드 혼합물 H-2의 항폐암, 암전이 효과가 확인 되면서, 몇 가지의 암세포에 대해 추가적인 in vivo (nude mice)실험이 실시 되었다. 하지만 대장암세포(SW620), 신장암세포(ACHN), 유방암세포(MDA-MB-231)를 이식한 누드마우스에서 H-2의 항암효과를 확인한 결과 어떤 암세포군에서도 유의성 있는 항암효과가 확인되지 않았다. 결론적으로, 다양한 특이 진세노사이드들이 효소반응을 포함한 sugar moieties를 hydrolysis 하는 특정 공정을 통해 효과적으로 생산되었으며, 그에 따른 각 진세노사이드의 분리, 정제 및 분석과 관련해서도 매우 효과적이고 독창적인 방법이 제시되었다. 또한 특정 진세노사이드들은 항폐암 효과 및 항암전이 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 특히, 진세노사이드는 단일 성분에서 보다는 특정 조성으로 혼합된 형태(H-2)가 더 좋은 결과를 주었으며, 그 최적화된 조성을 찾는 것과 관련해 본 연구는 매우 효과적인 방법을 제시하였다. 하지만 그 조성물(H-2)은 dose-dependent 하지 않고 특정 dose에서 가장 좋은 결과를 보여주는 다소 의아한 결과를 주었다. 이 결과는 최근에 Idio-syncratic drug reactions (IDRs)으로서 불려지고 있지만 그 중요 기전은 보고 되지 않고 있다. 또한, 조성물(H-2)는 경구투여에 비해 주사투여 시 보다 좋은 항암전이 효과를 보여 주었으며, 그 이유로는 진세노사이드의 체내 메타볼리즘에 따른 약물전달(drug delivery)의 불리함에서 기인된 것으로 판단된다. 끝으로, 조성물(H-2)을 비롯한 각각의 특정 진세노사이드들은 다양한 암세포 중에서도 특히, 낮은 농도에서 폐암세포에 효과적이었으며, 다른 암세포에 대해서는 보다 높은 dose의 연구가 추가적으로 필요하다고 생각된다. 하지만 항암제 후보로서 낮은 dose는 필수적이며, 이런 의미에서 항폐암제로서의 조성물(H-2)의 가능성은 매우 높다고 확신한다

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCBE 13011
형태사항 viii, 70 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 허율
지도교수의 영문표기 : Ji-Won Yang
지도교수의 한글표기 : 양지원
수록잡지명 : "An application of β-glycosidase to transformation of ginsenosides for the effective production of specific ginsenosides with biological efficacy". Biotechnology and Bioprocess Engineering, v. 17, issue 3, pp. 538-546(2012)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명화학공학과,
서지주기 References : p. 63-65
주제 ginsenoside
anti-cancer
lung cancer
Rg3
Rh2
진세노사이드
항암
폐암
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