To examine six A. thaliana (AT) genes, the DJ-1 family belonging to this family, for their similarities to the previously characterized novel glyoxalase. Based on their protein similarities, the six genes are classified into two subgroups, DJ-1 and PH1704 homologs. Unlike the members from other species, all the AT genes have repeated homology domains in a single gene, presumably forming an intramolecular dimer. For the five genes containing at least one invariant catalytic cysteine, attempts to express proteins in Escherichia coli were made after clonings of the cDNAs into appropriate vectors. The protein from DJ-1d belonging to PH1704 homologs exhibits the highest activity toward glyoxals with the Km of 0.10 mM, 0.27 mM and the kcats of 1700 min-1, 2200 min-1, respectively, while the DJ-1a and b showed considerably activity to glyoxal. The other three proteins were extremely low activity or not. For the DJ-1d, the predicted catalytic residues, the core Cys and Glu residues as well as His and Glu at the intramolecular interface, were mutated to alanines. As in other enzymes characterized so far, the changes in either Cys or Glu residue of both domains completely abolished enzymatic activity, whereas the double changes in the interface residues significantly decreased the activity. The protein is oligomeric with the size of approximately 112 kDa, corresponding to a trimer, based on data obtained with gel filtration chromatography. Configuration of the catalytic residues and oligomeric property of the DJ-1d enzyme are different from that of animals and bacteria, suggesting that the plant en-zyme is originated by creating a catalytic structure. When the wild-type DJ-1d enzyme was expressed, the strain became resistant to glyoxals, which is comparable to the resistance level exerted by the wild-type E. coli. However, effects of the catalytic mutants on enzyme activity were almost negligible.
최근 대장균과 사람의 DJ-1이 새로운 glyoxalase로서의 기능을 규명함에 따라 아기장대에서 찾은 후보 유전자 6개를 가지고 테스트를 하였다. 이들의 서열 유사성에 근거하여 6개의 유전자들은 사람의 DJ-1유전자와 Pyrococcus horikoshii 의 PH1704 유전자의 유사체를 포함하는 2개의 하위그룹으로 분류되는 것을 알 수 있었다. 다른 종들의 DJ-1유전자들과는 다르게 아기장대의 6개 모두 다 유전자 중복으로 인한 두 개의 반복되는 도메인을 가지고 있었다. 이 6개의 아기장대 DJ-1 (a~f) 들이 methylglyoxal (MG)과 glyoxal (GO)에 관한 새로운 glyoxa-lase 기능을 가지고 있는지를 확인하기 위하여 대장균에서 단백질을 발현시켰다. 이들 중 PH1704그룹에 포함된 DJ-1d는 MG와 GO에 대해 가장 높은 효소활성을 나타냈으며, MG와 GO에 대해 각각 Km은 0.10 mM, 0.27mM, kcat은 1700과 2200 min-1 값을 얻었다. DJ-1a과 DJ-1b glyoxalase는 GO에 관해서만 높은 specificity를 보였고 나머지 3개의 유사체들은 효소적 활성이 없거나 glyoxals에 관해서 매우 낮은 활성을 보였다. DJ-1d의 효소적 활성에 관여할 것이라고 추정되는 active site의 Cys-120/313과 Glu-19-212, 중합면에 위치한 His-121/314와 Glu-94/287에 대해 각각 Alanine으로 바꾼 mutants를 도입하였다. Active site에 위치한 Cys와 Glu 잔기의 mutation은 효소활성을 완전히 나타나지 않는 것으로 나왔으며, 중합면의 잔기들의 mutation 역시 효소활성을 감소시키는 것으로 나타났다. DJ-1d의 촉매 잔기들의 배치와 중합체의 형성은 기존의 대장균과 사람들의 DJ-1과는 다르다는 것도 알 수 있었다. 그리고 DJ-1d를 대장균에서 발현시켰을 때 MG와 GO에 대해 내성을 갖게 된다는 것을 확인할 수 있었다.
