Chinese hamster ovary (CHO) and human embryonic kidney 293 (HEK293) cells are the most popular host cells for transient production of therapeutic proteins. Recently, the transient gene expression (TGE) system has been considered as an appealing alternative to stable cell line construction technology for the rapid and cost-effective production of therapeutic proteins for high-throughput screening and pre-clinical analysis (Rosser et al. 2005). HEK293E cells have been used for the TGE platform due to their high transfection effi-ciency and productivity. CHO cells are preferred because protein production with similar characteristics in further stable cell line production, even though productivity is lower than HEK293E cells. These host cells require high transfection efficiency in order to enhance productivity because plasmids are retained and ex-pressed in an episomal condition. In addition, every batch to produce recombinant proteins using the TGE technique needs a discrete transfection process. Therefore, the selection of an inexpensive and efficient trans-fection reagent is the primary interest. Taken together, attempts to enhance the productivity using the TGE system with efficient gene delivery polymer, polyethylenimine (PEI), in CHO and HEK293 cells have been made in this study.
PEI, a cationic polymer, has been used widely in TGE because it is inexpensive and capable of effi-cient gene delivery. PEI condenses DNA into nanostructures, forming DNA/PEI polyplexes, which are then internalized through endocytosis. The formulation of DNA/PEI polyplexes, which is often described as the N/P ratio, plays an important role in both transfection efficiency and cell viability. The transfection efficiency is inversely related to the toxicity of PEIs. More PEIs increase the transfection efficiency but induce more cytotoxicity. PEI is known to have relatively low cytotoxicity at working concentrations, yet it can induce cytotoxicity because a large amount of free PEIs can cause membrane damage. Thus, the beneficial effect of using a high concentration of PEIs on transfection efficiency is often compromised by its cytotoxic effect on cell viability. The suppression of cell death induced by PEIs may further increase the transfection efficien-cy, resulting in an improved TGE. A robust CHO cell line overexpressing Bcl-2 was established to suppress PEI-induced apoptosis during transfection. Along with increasing N/P ratios, we investigated the effect of Bcl-2 overexpression on transfection efficiency, viability, and cell death pattern during transfection. Furthermore, batch cultures, followed by transfection, were performed to determine whether the suppression of PEI-induced cell death improves TGE.
Most mammalian cells express heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) on the cell surface. Recent studies have shown the close relationship between HSPGs and gene delivery via endocytosis. Understanding the mechanism of cationic complex delivery into cells is important to control the transfection efficiency and gene expression. Cell surface proteoglycans perform a range of functions such as cell proliferation, differenti-ation, migration, cell-cell communication, and also gene delivery. The negatively charged proteoglycans in-teract with positively charged transfection complexes and uptake the complexes via endocytosis. To study the relationship between HSPGs and TGE productivity, mRNA expression, HSPG synthesis, HSPG degrada-tion, transfection efficiency and TGE experiments were performed on a daily basis. DG44 possessed signifi-cantly more abundant HSPGs than HEK23E both intracellularly and on the membrane. Transfection effi-ciency was also higher in DG44 cells, verifying the correlation between HSPGs and endocytosis of cationic polyplexes. Reduction of HSPGs can be explained by several reasons, we suggested increased heparanase activity could be a possible reason. Several enzymes related with HSPG biosynthesis were analyzed by using qRT-PCR, suggesting that they are clearly connected with cell growth and HSPG synthesis patterns, but the actual HSPG synthesis pattern could not be quantificationally related with the enzyme expression.
To investigate the effect of HSPG synthesis-related gene overexpression on transient transfection effi-ciency using PEIs, syndecan-1 (Sdc1) and xylosyltransferase (XT) overexpressing cells were constructed. Sdc1 overexpressing and Sdc1/XT2 co-overexpressing cells expressed higher amount of HSPGs than wild-type cells. These overexpressing cells also exhibited higher transfection efficiency using PEIs as a transfection reagent. On the other hand, humanized antibody-producing TGE cultures revealed similar level of antibody titers between wild-type and overexpressing cells in DG44. However, Sdc1 overexpressing HEK293E cells showed considerably increased antibody titer compared to the wild-type HEK293E cells. Thereby, the trans-fection efficiency and the recombinant protein production were improved by Sdc1 overexpression, and sim-ultaneous overexpression of Sdc1 and XT2 in DG44 cells exhibited even better performance than Sdc1 over-expression.
In conclusion, anti-apoptotic engineering blocked the cell death of CHO and HEK293 cells under tox-ic transfection process using PEIs, which resulted in increase of the transfection efficiency and the specific productivity. Additionally, HSPG engineering efficiently enhanced transfection efficiency and productivity.
Chinese hamster ovary (CHO) 와 human embryonic kidney 293 EBNA (HEK293E) 세포는 치료용 단백질 생산을 위해 대표적으로 사용되는 세포이다. 최근들어 고속대량 스크리닝 및 전임상 실험용의 치료용 단백질을 생산하는 데 있어, 빠르고 비용 절감 효과를 가지는 단백질 일시발현 시스템 (transient gene expression system)이 안정적 세포주 구축 기술을 대신하여 각광받고 있다. CHO 세포는 HEK293E 세포에 비해 일시발현 시스템을 이용한 단백질 생산량이 낮음에도 불구하고 차후 안정적 세포주 구축을 대비하는 일환에서 생산되는 단백질의 특성을 일치시킨다는 점에서 선호되는 세포이다. CHO와 HEK293E 세포에서 일시발현으로 단백질을 생산할 때 생산량을 증대하기 위해서는 플라스미드의 트랜스펙션 효율을 높여야 한다. 이는 일시발현 시스템에서 플라스미드가 에피솜 상태로 발현되고, 매 회 생산 시마다 트랜스펙션을 거쳐야 하기 때문이다. 따라서 저비용, 고효율을 보이는 트랜스펙션용 시약 선택이 매우 중요한 관심사이다. 본 연구에서는 CHO와 HEK293E 세포를 이용한 단백질 일시발현 시스템에서의 생산성 증대를 위해 폴리에틸렌이민(PEI)을 트랜스펙션 시약으로 선택하여 연구를 수행하였다.
PEI는 양이온성 폴리머로 가격이 저렴하고 유전체 전달에 효과적이기 때문에 많이 사용되고 있다. PEI는 DNA와 polyplex를 형성한 후 endocytosis를 통해 세포 내로 유입된다. PEI와 DNA의 배합은 보통 N/P ratio로 표기하는데, 이 비율은 트랜스펙션 효율과 세포 생존률에 중요한 영향을 미친다. PEI가 많이 사용될수록 트랜스펙션 효율이 높아지지만, 높은 세포사를 유발한다. 따라서 고용량의 PEI 사용으로 인한 부가 혜택이 세포 독성으로 인해 반감된다. 항apoptosis 유전자인 Bcl-2를 과발현한 CHO 세포에서는 PEI로 인한 세포사를 저해함으로써 트랜스펙션 효율과 생산성이 증가되는 효과를 볼 수 있었다. N/P ratio가 증가함에 따른 세포 생존률, 트랜스펙션 효율 및 트랜스펙션 과정 중의 세포사 패턴을 검증한 결과, 높은 N/P ratio에서 Bcl-2 과발현 CHO 세포가 기존의 세포에 비해 높은 세포 생존률과 트랜스펙션 효율을 보였으며, 트랜스펙션 과정 중의 apoptosis 및 비 apoptosis 성 세포사도 효과적으로 저해함을 검증하였다. 또한, 항체 생산을 통해 생산성을 측정한 결과 역시 Bcl-2 과발현 세포주가 높은 생산량 및 단위세포당 생산성을 보였다. 이를 통해 Bcl-2 과발현을 통해 세포 자체가 견고해짐으로써 더 많은 PEI/DNA polyplex를 받아들임에도 그로 인한 세포사를 저해하여 결과적으로 생산성이 높아짐을 확인할 수 있었다.
대부분의 동물 세포는 세포막 표면에 heparan sulfate proteoglycan(HSPG)을 발현한다. 최근의 연구들이 HSPG과 endocytosis 간의 밀접한 관계를 시사한 바 있다. 따라서 치료용 단백질 생산에 가장 활발히 사용되는 CHO와 HEK293E 세포의 HSPG 발현 과정 및 패턴에 대한 연구를 수행함으로써, 트랜스펙션 효율 및 생산을 증대할 수 있는 잠재적인 요소들을 발견하고자 하였다. CHO와 HEK293E 세포 내에 존재하는 HSPG 생합성 관련 mRNA 발현량 분석, 면역염색법에 이은 공초점 현미경 및 FACS 기법을 이용한 HSPG 발현량 및 발현 패턴 분석, 그리고 HSPG 분해 관련 효소의 활성 측정 등을 통해, CHO 세포가 HEK293E 세포에 비해 다량의 HSPG를 보유함을 알 수 있었다. CHO 세포는 HEK293E 세포에 비해 트랜스펙션 효율이 높다. 따라서 트랜스펙션 효율과 세포 내 HSPG의 양과는 밀접한 관계가 있는 것으로 보인다. HSPG 생합성 관련 mRNA는 각 세포 내에서 세포 생장과 비슷한 패턴으로 발현되며, 이것이 세포 내의 HSPG 발현과도 관계함을 알 수 있었다. 또한 각 세포 내에서 시간이 지남에 따라 세포막 HSPG가 감소하는 원인 중 하나로 증가한 heparanase의 활성을 들 수 있었다. 본 연구는 세포막 HSPG가 트랜스펙션과 밀접한 관계가 있음을 밝힘으로써, 이와 관련된 세포 엔지니어링을 통한 트랜스펙션 효율 및 생산성 증대에 대한 가능성을 제시하였다.
위의 결과를 바탕으로, HSPG 생합성에 관계된 Syndecan 및 Xylosyltransferase의 과발현을 통해 HSPG 과발현 유도를 시도하였고, 이렇게 HSPG가 과발현된 세포가 트랜스펙션 효율 및 생산성에 긍정적인 효과를 미치는지 알아보았다. CHO 세포에서는 Syndecan 과발현 세포주 및 Syndecan/Xylolsyltransferase 동시과발현 세포주를 만들었고, HEK293E 세포에서는 Syndecan 과발현 세포주를 구축하였다. 결과적으로 과발현시킨 세포주 모두 HSPG 양이 증가한 것으로 나타났다. CHO 세포에서는 Syndecan 과발현 및 Syndecan/Xylosyltransferase 동시 과발현 세포 모두 경미하게 증가한 트랜스펙션 효율 및 단백질 일시발현 생산성을 보였다. 그러나 Syndecan 과발현 HEK293E 세포는 트랜스펙션 효율 및 단백질 일시발현 생산성 모두 현저히 증가함을 보였다. 이러한 정도의 차이는 기존에wild-type 세포들이 가지고 있던 HSPG의 양과도 관련된 것으로 추정된다. 본 연구를 통해 세포막에 존재하는 HSPG의 양을 조절함으로써 트랜스펙션 효율 및 생산성을 증가시킬 수 있는 가능성을 제시하였다.
결론적으로, CHO와 HEK293 세포에서 PEI를 이용하여 단백질 일시발현을 수행할 시, 항세포사 개량 및 HSPG 생합성 개량을 통해 트랜스펙션 효율과 생산성을 성공적으로 증대시킬 수 있음을 검증하였다. 이로써 단백질 일시발현 시스템을 이용한 치료용 단백질 생산성을 증대시킬 수 있는 효율적인 세포 개량 전략을 수립하였다.
