Cell-penetrating peptides (CPPs) have proven very effective as intracellular delivery vehi-cles for various therapeutics. However, there are some concerns about non-specific penetra-tion and cytotoxicity of CPPs for effective cancer treatments. Herein, based on the cell-penetrating motif of an anticancer peptide, buforin IIb, we designed several CPP derivatives with cancer cell specificity. Among the derivatives, a 17-amino acid peptide (BR2) was found to have cancer-specificity without toxicity to normal cells. After specifically targeting cancer cells through interaction with gangliosides on the cancer cell surface, BR2 enters cells via lipid-mediated macropinocytosis in concentration-dependent manner. Moreover, BR2 showed higher membrane translocation efficiency than a well-known CPP Tat (49-57). The protein delivery efficiency of BR2 was proved by fusion with the 28-kDa enhanced green fluorescent protein (EGFP). BR2-fused EGFP was successfully delivered into HeLa cells and distributed mainly within the cytoplasm. Furthermore, the capability of BR2 as a cancer-specific drug carrier was demonstrated by fusion of BR2 to a single-chain variable fragment (scFv) directed toward a mutated K-ras (G12V). BR2-fused scFv induced significant growth inhibition and triggered a higher degree of apoptotic cell death of K-Ras-mutated HCT116 cells than Tat-fused scFv. Furthermore, BR2-fused scFv inactivated GTP-Ras proteins insi de tumor cells mediated via neutralization by specific binding between mutated Ras and BR2-scFv fusion proteins. These results suggest that the novel cell-penetrating peptide BR2 has great potential as a useful drug delivery carrier with cancer cell specificity.
본 실험실에서는 지난 수년간의 연구를 통해, 항균 펩타이드 buforin에서 유래한 buforin IIb가 우수한 세포 투과 능력과 암세포 특이성 및 강한 항암력을 보인다는 것을 밝혀냈다. 하지만 buforin IIb는 높은 농도에서 정상세포에도 비교적 높은 독성을 보이는 것으로 확인되었다. 따라서 본 연구에서는 buforin IIb peptide가 가진 우수한 암세포 특이성과 세포막 투과 능력을 기본으로 하여, 암세포에 특이성이 있고 정상 세포에 독성이 없는 새로운 세포막 투과성 펩타이드 BR2를 개발하였고, 이를 다양한 의약 단백질의 세포 내 운반체로서 이용하고자 하였다.
BR2 펩타이드는 다양한 암세포에서 기존에 잘 알려진 세포막 투과 펩타이드인 Tat보다 우수한 세포막 투과성을 보여준 반면, 정상세포 내부에는 잘 들어가지 않았고, 세포 독성을 보이지도 않았다. 또한 BR2는 세포 내에 들어가서 핵과 세포질에 골고루 분포함을 확인하였다. BR2 펩타이드의 암세포 특이성을 나타내는 이유를 살펴본 결과, 다른 세포막 투과성 펩타이드들이 세포막의 Glycosaminoglycans (GAG)와 정전기적 상호작용에 의해서 붙어서 들어가는 반면, BR2는 암세포에서 특이적으로 과발현되는 ganglioside와 상호작용하여 암세포를 인지하는 것으로 확인되었다. Ganglioside를 통해 암 세포막을 인지한 후 lipid-raft mediated macropinocytosis로 세포 내로 들어가지만, 리소좀에 의한 분해작용은 피하는 것을 확인하였다. 또한, EGFP 를 붙여서 BR2에 세포 내로 들어가는 지 여부를 확인한 결과, BR2는 EGFP를 효과적으로 세포 내로 운반하였고, 세포 내로 들어간 EGFP는 주로 세포질 내에 고르게 분포하였다. 이 실험을 통해 BR2가 세포 내로의 단백질 운반체로서 사용 가능함을 확인하였고, 세포질의 물질을 표적하는 단백질의 이용에 적합함을 알았다.
BR2를 의약용 단백질의 운반에 응용하기 위해 세포 내부에서 생리활성을 나타내는 항체를 세포 투과성 펩타이드에 붙여 외부에서 발현 시킨 후, 단백질의 형태로 직접 세포 내에 전달하는 방법을 이용하였다. 항체는 다양한 분자들에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가진다는 특성 때문에 매우 유용한 의약용 단백질이지만, 분자량이 큰 항체를 효과적이고 안전하게 생체 내로 전송시킬 수 있는 방법이 개발되지 않아 세포 내부에 작용하는 항체의 이용에 한계가 있었다. 이 연구에서는 모든 암의 30%에서 과발현 양상을 보이는 Ras를 표적하여 Ras 단백질에 의해 매개되는 다양한 세포내 신호를 억제하는 anti-Ras single chain variable fragment (scFv)를 BR2에 융합시켰다.
BR2-anti-Ras scFv를 대장균에서 발현시킨 후, 변이된 Ras 를 발현시키는 암세포에 처리한 결과, 2시간 이내에 세포에 효과적으로 들어가는 것을 확인하였고, 활성화된 Ras-GTP의 양이 현저히 감소함을 알 수 있었다. 또한 암세포에 내에서 apoptosis를 유도하여 살아있는 암세포의 수를 급격히 감소 시킴으로써 효과적인 항암 작용을 나타냄을 확인하였다.
본 연구는 암세포 특이성과 향상된 세포 침투 능력을 갖는 펩타이드를 이용한 의약용 단백질 전달 시스템의 개발이라는 측면에서도 중요할 뿐 아니라, target세포 내부로의 효과적인 이동이 가능한 세포 투과성 항체-치료제로의 개발로 세포 치료의 새로운 가능성을 열 수 있다는 점에서 매우 중요한 의미를 갖는다. 또한 기존의 항체 치료제를 이용함에 있어서 나타나던 여러 가지 문제점 등을 극복하고, 항체를 목표한 암세포 부위에서만 국소적으로 작용할 수 있게 하는 새로운 표적치료제로 이용할 수 있을 것이다.
