Seed dormancy, a seed status that prohibits germination even in the presence of inductive germination signals, is one of the poorly understood processes. In Arabidopsis, seed dormancy is established during seed maturation and is released after the harvest. To identify molecular components that regulate seed dormancy, we screened T-DNA insertion lines and identified two mutants named as honsu (hon) and hypnos (hyp). Both mutants require a prolonged period of after-ripening.
The HON loss-of-function mutants display deep seed dormancy, whereas HON-overexpressing lines display shallow seed dormancy. HON encodes a seed-specific group A protein phosphatase 2C (PP2C) and is one of major negative regulators of seed dormancy among group A PP2Cs, while other members including AHG1 and AHG3 are minor regulators that redundantly inhibit seed dormancy. Like other PP2C family members, abscisic acid (ABA) receptor Pyrabactin resistant 1/Regulatory components of ABA receptor 11 (PYR1/RCAR11) interacts with HON and inhibits PP2C activity of HON in the presence of ABA. Our analysis indicates that HON inhibits ABA signaling and activates gibberillin (GA) signaling, and both of these conditions must be satisfied to promote the release of seed dormancy. However, HON mRNA levels are increased in mutants displaying deep seed dormancy or under conditions that deepen seed dormancy, and decreased in mutants displaying shallow seed dormancy or under conditions that promote the release of seed dormancy. Our results indicate that the expression of HON mRNA is homeostatically regulated by seed dormancy.
The HYP loss-of-function mutants also display deep seed dormancy. Germination frequencies of hyp-1 and hyp-2 increased during seed after-ripening but the kinetics of germination was slower than that of WT. In addition, 1 day cold-imbibition is not enough to break the seed dormancy of hyp mutant. However, ectopic expression of HYP didn’t show the reduced seed dormancy. HYP mRNA is expressed mainly in the mature dry seed but ubiquitously expressed in the whole plants. Quantitative RT-PCR analysis reveals that ABA and GA metabolic genes were altered in the hyp mutant: GA3ox1 is down-regulated, GA2ox2, NCED6 and NCED9 is up-regulated, which cause lower GA levels and higher ABA levels in hyp-1 than in WT. hyp mutants also have pleiotropic phenotype such as bigger seed size and longer hypocotyl length under low intensity of red light. HYP encodes an unknown protein which contains Lissencephaly type-1 like homology (LisH) domain, C-terminal LisH (CTLH), and CT11-RanBPM associated (CRA) domain. The functions of these domains are largely unknown. The three closest homologs of HYP are present in Arabidopsis and named as HYP-like1 (HYPL1), HYPL2, and HYPL3. We found that hypl1-1 knockout mutant is embryo lethal and only hypl2 mutant has dormancy phenotype.
Taken together, our results indicate that HON and HYP promote the release of seed dormancy to induce seed germination.
종자 휴면이란 발아를 유도하는 신호가 주어져도 발아를 하지 못하는 종자의 상태를 의미하는데, 현재까지 종자 휴면에 대해서 많이 알려져 있지 않은 상태이다. 애기장대에서는 종자의 발달 단계에서 종자 휴면이 시작되어 휴면 상태가 증가하게 되고, 종자 수확 후에 휴면 상태가 점차 감소해서 발아를 할 수 있는 상태가 된다. 우리는 종자 휴면을 조절하는 분자생물학적인 요소들을 찾기 위해서 T-DNA가 삽입된 돌연변이체들을 선별했고, 그 결과 honsu와 hypnos라는 종자 휴면 상태가 강해서 발아를 잘 하지 못하는 두 돌연변이체를 찾았다.
HONSU (HON)의 기능을 상실한 돌연변이체는 종자 휴면 상태가 강했으며, 반면 HON을 과발현 시킨 식물체는 종자 휴면 상태가 약해서 발아를 잘했다. HON은 종자 특이적으로 발현되는 인산가수분해효소(PP2C) 단백질이며, group A PP2C 들 중에서 AHG1과 AHG3와 함께 앱식산 신호전달 과정을 억제하는 대표적인 단백질 중 하나이다. 다른 PP2C들과 마찬가지로 앱식산이 존재할 때 앱식산 수용기인 PYR1/PYLs/RCARs이 HON과 결합을 해서 HON의 PP2C 활성을 억제한다. HON은 종자 내에서 앱식산 신호전달을 억제하고, 지베렐린 신호전달을 활성화 시켜 종자가 발아를 잘 할 수 있는 상태를 만든다. 하지만, HON 자체의 mRNA 발현이 그의 기능과는 반대로, 종자 휴면 상태가 약할 때에 감소하고, 종자 휴면 상태가 강할 때에 증가하는 것으로 보아, HON의 mRNA 발현은 종자 휴면 상태에 의해서 항상성을 유지하는 방향으로 조절된다고 볼 수 있다.
또 다른 돌연변이체인 hypnos (hyp) 역시 HYP의 기능을 상실한 돌연변이체가 강력한 종자 휴면을 보여서 발아를 잘 하지 않는다. 하지만 우리는 실험을 통해 HYP을 과발현 시킨 식물체의 종자 휴면은 돌연변이체와 달리 야생형과 크게 차이가 나지 않는다는 것을 알았다. HYP의 mRNA 발현은 HON과 비슷하게 종자 특이적으로 나타나지만, HON과 다르게 다른 여러 조직에서도 나타난다. HYP은 앱식산과 지베렐린 생합성에 관련된 여러 유전자들을 조절하고, 이를 통해서 돌연변이체가 발아를 잘 하지 못하도록 한다. HYP단백질은 LisH, CTLH, CRA라는 단백질-단백질 결합에 관련된 도메인들을 가지고 있으며, HYP의 3가지 상동 단백질 (HYPL1, 2, 3) 돌연변이체들의 분석을 통해, hyp외에 hypl2 돌연변이체 역시 종자 휴면 상태를 조절하는 것으로 확인되어 앞으로 둘 간의 관계에 대한 연구가 더 필요할 것으로 보인다.
종합해보자면, 이번 연구는 HON과 HYP이 종자 휴면 상태를 깨뜨려서 종자 발아를 촉진하는 역할을 한다는 것을 보여준다.
