Xylan is a major component of hemicellulose which is considered to be the second most abundant natural polymers in nature and it is regarded as one of the most important renewable resources. By enzymatic reaction, xylan can be degraded into xylose, its main building block, and then the resulting sugar (xylose) can be used as a major carbon source in the growth of microorganisms and further production of useful things. In this study, I engi-neered Corynenacterium glutamicum for the direct utilization of xylan as a carbon source. C. glutamicum is a Gram positive, non-sporulating bacteria and is also one of the most important bacteria in the industrial production of various chemicals and biomolecules including amino acids, lactate, and recombinant proteins. Overall scheme of this research was two-step process comprising (i) enzymatic hydrolysis of hemicellulose and (ii) xylose utilization as a carbon source by introducing heterologous xylose metabolic pathway. For the hydrolysis of xylan, two heterologous enzymes (endoxylanase and xylosidase) were expressed in C. glutamicum. The xylan can be decomposed into xylobiose or xylotriose by secreted endoxy-lanase in the media and then further hydrolyzed into xylose in the cytoplasm of cells. Due to the lack of xylose metabolic pathway, wild type of C. glutamicum cannot utilize the xylose as a carbon source. Next, to give the ability of xylose metabolism, heterologous cytoplasmic expression of the xylose isomerase (xylA) and xylulokinase (xylB) genes were introduced in C. glutamicum, mediating the conversion of xylose into xylulose 5-phosphate (an intermediate of the pentose phosphate pathway). As a result, xylose metabolism could be successfully introduced and I confirmed the cell growth by utilization of xylose as a carbon source in minimal media. Finally, two steps (xylan hydrolysis and xylose metabolism) were successfully combined as a whole cell system in which xylan can be directly utilized for growth of C. glutamicum.
헤미셀룰로오스는 셀룰로오스 다음으로 자연계에서 가장 많은 양을 차지하는 바이오매스의 하나로, 목재를 이용한 종이나 펄프산업에서 많이 배출되는 산업 폐기물의 주성분이다. 최근에 바이오매스를 이용하여 바이오 에탄올과 바이오 디젤과 같은 연료를 만드는 연구가 활발히 이루어 지고 있으나, 주로 이용되는 바이오매스는 셀룰로오스 계열이며 자일란과 같은 헤미셀룰로오스의 이용은 미미한 수준이다. 따라서 본 연구의 목표는 앞서 언급한 것과 같이 지구상에서 가장 풍부한 바이오매스중 하나인 헤미셀룰로오스를 분해하여 성장이 가능한 균주를 개발 하는 것이다.
이러한 목표의 연구를 위한 첫 단계는 자일란이 먼저 세포 밖에서 분해되는 것이다. 자일란이 분해되어 세포 안으로 들어 올 수 있는 형태가 되어야 다음 단계가 쉽게 이루어 질 수 있기 때문에 자일라네이즈의 세포 외 분비 발현 효율이 전체 연구에 큰 영향을 미친다. 때문에 자일라네이즈의 생산성을 증대시키고 세포 외 분비를 높이기 위해, 효과적인 분비생산 시스템을 구축하기 위한 새로운 신호전달펩타이드를 발굴하는데 성공하였다. 이 신호전달펩티드와 프로모터를 이용하여 자일라네이즈 뿐만 아니라 여러 가지 외래 단백질의 세포외 발현을 확인함으로써 코리네박테리움에서 이용할 수 있는 효과적인 세포외 분비생산 시스템을 확립하였다. 이렇게 발현된 자일라네이즈에 의해 세포 밖에서 분해된 자일란은 자일로 올리고머의 형태로 세포 안에 유입될 수 있다. 자일로올리고머의 자일로오스로의 분해를 위하여 바실러스 및 클렙시엘라 균주 유래 자일로시데이즈 유전자 발현 시스템을 제작하였으며, 활성 측정 결과 자일로오스의 생성 효율이 매우 높은 상태로 유지됨을 확인하였다.
하지만 야생형의 코리네박테리움은 자일로오스 대사경로를 가지고 있지 않아 자일로오스를 세포성장의 탄소원으로 이용할 수 없다. 이를 극복하기 위해 다음 단계로 대장균으로부터 자일로오스 대사에 관여하는 자일로오스 아이소머레이즈와 자일룰로 카이네이즈, 두 가지 효소를 코리네박테리움에 도입하여 자일로오스의 이용성을 확인하였다. 자일로오스와 글루코스가 함께 있는 배지에서 개량된 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하였을 때 글루코스만 소모하는 야생형과 달리 개량된 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우 글루코스가 고갈과 동시에 자일로오스를 소모하기 시작하여 세포 성장이 지속되는 것을 확인하였다.
앞서 확인된 모든 단계를 종합하여 자일란 분해 및 자일로오스 대사 경로에 관련된 일련의 효소 시스템을 모두 하나의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 도입하여 소위 콘솔리데이티드 시스템을 구축하였으며, 이로부터 지구상에 가장 풍부한 바이오매스중의 하나인 헤미셀룰로오스(자일란)를 직접 탄소원으로 이용할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 개발하였다. 자일란과 글루코스가 있는 배지에서 야생형 균주와 콘솔리데이티드 시스템이 구축된 코리네박테리움 균주의 생장과 배지 분석을 통하여 배지내에 존재하는 자일란이 분해되어 자일로올리고머가 생성되는 것과 그로부터 만들어진 자일로오스를 이용하여 생장이 높아지는 것을 확인하였다. 하지만 자일란의 이용성이 산업적으로 쓰일 만큼 높은 수준은 아닌 것으로 보이며, 이를 더욱 효율적인 시스템으로 개량하기 위한 연구가 필요한 것으로 보인다.
현재 코리네박테리움 글루타미쿰에서 더욱 효과적인 발현시스템을 제작하기 위해 합성 프로모터 라이브러리를 제작하고, 이로부터 초고속 선별 기법을 사용하여 강력한 프로모터들을 발굴하는데 성공하였으며 이론적인 분석을 통해 일반적으로 쓰일 수 있는 합성생물학 기반의 틀을 만들고자 연구를 진행하고 있다.
본 연구는 지구상에서 가장 풍부한 헤미셀룰로오스를 분해하여 성장이 가능한 균주를 개발을 하는데 성공을 함으로써, 더 나아가 바이오매스를 이용한 방향족 화합물 생산 공정 등과 같은 고부가가치 방향족 화합물의 저비용 생산 공정을 확립하는데 토대를 만들었다는데 큰 의의가 있다.
