In vitro construction of biomimetic intestinal microenvironment has received much attention due to their special structures and related functions of epithelium. For example, closely packed array of villus and crypt structure increase the total surface area of intestinal epithelium for effective contact with nutrients. The projected structure is crucial for regulating intestinal stem cell proliferation, migration, and intestinal renewal. This structure also provides more effective cell-to-cell interaction within epithelium. In the aspect of drug permeability, gastrointestinal (GI) tract is a primary barrier of first-pass metabolism of oral administered drug. However, microfabrication of long villus structure with high aspect ratio needs complicated fabrication processes using special equipment. In addition, precise control of microenvironment has been limited in conventional methods. In this thesis, we report a novel method of hybrid biomicrofabrication using hydrogel villi structures integrated with microfluidic device to develop a biomimetic intestinal microenvironment system for more physiologically relevant study. A microfluidic device, which was fabricated with poly(dimethylsiloxane) (PDMS), was used in order to develop three-dimensional (3D) cell culture environment under fluidic condition with precise control of reagents and chemicals. We fabricated various sizes of hydrogel villi structures using mixture of alginate and collagen by replica molding from the PDMS mold without any complicated fabrication process. We proposed a latch and hook structure to stably lock-up hydrogel villi structure inside the chamber of a microfluidic device. Assembled hydrogel villi structures were maintained stably under flow condition and showed flexible responses to flow. Human epithelial colorectal adenocarcinoma cell (Caco-2) was cultured on hydrogel villi structures for 7 days and observed that Caco-2 cell adhered to hydrogel surface and proliferated. This hybrid fabrication method may be integrated with other 3D cell culture platform such as organ-on-a-chip, and could be applicable to in vitro assay with targeted organ.
본 연구에서는 수화젤 구조체를 PDMS 채널과 조립하는 방법을 이용하여 장내 미세 환경을 유체 환경 내에서 구현하는 방법을 제안하였다. 기존에는 장내 미세 환경의 구조적인 모사에 집중하여 실제 장내에서와 같은 여러 세포들의 공생배양 밑 유체 환경의 구현에 어려움이 있었으며, 높은 형상비(Aspect ratio)를 가진 길이가 긴 융털 구조를 제작하기 위해 특수한 장비들을 사용해야 하는 복잡한 공정 과정을 거쳐야 하는 한계점을 나타냈다. 이런 단점을 극복하기 위하여 수평 방향 공정 방법으로 제작한 수화젤 구조물을 PDMS 채널과 결합함으로써 기존의 복잡한 공정과정 없이 다양한 크기의 융털 구조를 유체 환경 내에서 구현하였다. 본 실험에서는 장내 융털을 모사한 수화젤 구조체로 알긴산염(Alginate)와 콜라젠을 1:2로 섞은 혼합물을 사용하였으며, 서로 다른 네 가지 크기의 수화젤 융털 구조를 제작하여 수화젤 구조의 크기 조절이 용이함을 보여주었다. 제작된 수화젤 융털 구조는 미세유체소자와 결합되어 실제 장내 환경과 같이 유체 환경 내에서 수직 방향으로 고정되어 유지됨을 보였다. 또한 미세유체소자 내의 유체가 흘러감에 따라 수화젤 융털 구조가 유연하게 휘어짐을 관찰하였다. 장내 미세 환경을 모사하기 위해 수화젤 융털 구조 표면에 대장암(Human epithelial colorectal adenocarcinoma, Caco-2) 세포를 배양한 결과 세포들이 성공적으로 부착하여 증식하는 것을 확인하였다. 하지만 수화젤 융털 구조와 결합된 미세유체소자에 세포를 주입하고 배양한 결과 대부분의 세포들이 융털 구조의 표면이 아닌 소자의 바닥 면에 부착하여 증식하는 것을 확인하였는데, 이는 수화젤 융털 구조에 비해 소자의 표면적이 상당히 크기 때문에 세포들이 상대적으로 소자의 표면에 많이 부착되어 발생한 것으로 파악된다. 미세유체소자 내 세포 배양 조건을 최적화 한다면 더욱 실제 체내 환경과 유사한 장내 미세 환경을 모사할 수 있을 것으로 기대된다. 본 연구에서 제안한 수평 방향 공정 방법을 이용하면 기존의 장내 환경 연구에 사용되었던 공정 방법에 비해 다양한 모양의 융털 구조를 손쉽게 제작할 수 있다. 또한 수화젤 혼합물의 조성을 바꾸어줌에 따라 물리적, 생리적 변화를 줄 수 있어 다양한 형태의 수화젤 구조와 결합하여 질병 모형 모사 및 개인 맞춤형 연구를 진행할 수 있을 것으로 전망된다. 그리고 유체 채널과 결합된 플랫폼의 장점을 이용하여 채널 내의 수화젤 구조물에서 배양되는 세포들이 다양한 방식으로 조절된 유체에 따른 반응도 확인할 수 있을 것이다. 마지막으로 본 연구에서 제안한 플랫폼은 다른 생체 모사 연구뿐만 아니라 체외 약물 검사, 올간온어칩(Organ on a chip) 등의 연구에도 다양하게 적용될 수 있을 것이다.
