Photodynamic therapy (PDT) has developed as one of promising systems in cancer therapy for its high-selectivity and low systemic cytotoxicity. However, the accessibility of external light limits the application on deeper tumor because of tissue-penetrating properties. In this study, bioluminescence (BL) enzyme protein- photosensitizer (PS) conjugates were synthesized using covalent bonging. Renilla luciferase8 (Rluc8), mutant of enzyme protein that has stability and high intensity BL, was employed as an internal light source. Chlorin e6, photosensitizer that has high singlet oxygen quantum yield, was covalently attached to Rluc8. Generation of reactive oxygen species (ROS) could be achieved through bioluminescence resonance energy transfer (BRET) from BL to photosensitizer. The amount of ROS produced from Rluc8-e6 conjugates was detected using singlet oxygen sensor green (SOSG), which shows fluorescence increase as ROS is generated. Our results show that Rluc8-e6 conjugates could be synthesized without distorting of properties of both materials and conjugates could generate ROS, which may be applied for PDT.
광역동 치료 (photodynamic therapy)는 특정 파장의 빛과 빛을 흡수하는 광감응제 (photosensitizer)를 이용해 활성산소를 생성하는 종양 치료법으로, 지금까지 널리 사용된 약물화학 법이나 수술과 같은 치료 방법에 비해 암 세포에 해단 선택 성이 높고, 그로 인해 정상세포에 부작용이 적어 임상에도 사용될 뿐 아니라, 많은 연구가 이루어지고 있다. 그 외에도 마취가 필요하지 않고, 치료 후 흉터가 남지 않는 장점이 있다. 하지만 시술과정에 빛이 필수요소 이기 때문에 빛 전달이 어려운 깊은 부위의 종양이나, 전이가 일어난 암에는 시술이 적합하지 않아 피부 암 치료에만 이용이 국한되어있다.
그러한 한계를 극복 하기 위해 광섬유를 이용한 방법, upconversion 나노 입자를 이용한 방법 그리고 화학발광 물질인 luminol을 이용한 방법들이 시도 되어왔다. 하지만 이러한 방법들도 여전히 외부 광원이 필요 하거나, 물질 자체에 독성이 있다는 단점이 있다.
이 연구에서는 외부 광원이 따로 사용되지 않고, 생체와 적합한 물질인 생체발광을 이용하여 내부 광원 물질을 만들었다. 생체 발광은 해파리나 반딧불이 에서 발견된 것으로 luciferase라는 생체발광 효소와 luciferin이라는 기질의 효소-기질 반응에 의해 빛이 난다. 이 연구에서 사용된 생체발광 물질은Renilla라는 산호초에서 발견된 생체 발광 단백질의 변형체인 Rluc8이다.
생체 발광이 내는 광자를 광감음제가 효율적으로 받기 위해 공영 에너지 전이 (RET)이라는 개념을 도입하기로 하였다. 형광성 공명 에너지 전이 (FRET)과 유사한 생체발광 성 공명 에너지 전이 (BRET)은 에너지를 주는 do-nor와 그 에너지는 받아 들이는 acceptor의 거리가 1~10 nm 사이 일 때 효과적으로 일어나며, donor의 발광 스펙트럼과 acceptor의 흡수 스펙트럼에서 겹치는 부분이 얼마나 되는지가 중요한 요소이다.
이 실험에서는 donor로 Rluc8이, acceptor로 chlorin e6라는 물질이 사용되었다. Chlorin e6는 FDA 승인을 받은 물질로, 활성산소 생성 수율이 높고 (0.61) carboxylic 그룹을 지니고 있어 단백질과 결합에 용이한 장점이 있다.
Rluc8의 발광 스펙트럼과 chlorin e6의 흡수 스펙트럼을 구해 겹쳐본 결과, 400 nm부터 700 nm 의 생체 발광이 chlorin e6에 의해 흡수 될 수 있음을 알았다. BRET 물질을 합성 하기 전에 400 nm의 빛으로 chlorin e6 가 활성산소를 생성할 수 있는지 SOSG (singlet oxygen sensor green)이라는 물질의 540 nm에서의 형광세기가 변하는 것을 이용하여 측정했다. 그 결과 665 nm의 빛을 주었을 때 보다 400 nm의 빛을 주었을 때 더 많은 활성산소가 발생되고, 생성된 활성산소가 세포 독성을 지니고 있음을 확인하였다.
BRET 물질을 합성하기 위해, Rluc8의 표면에 존재하는 amine 그룹이 chlorin e6 표면의 carboxylic 그룹과 화학 촉매인 EDC의 도움을 받아 펩티드 결합을 통해 안정적으로 연결되었다. 합성 된 물질들의 흡수 스펙트럼과 각 물질들의 흡수 스펙트럼을 비교하여 합성 비율이 계산되었다. 실험에서의 최대 Rluc8: e6 비율은 1: 0.6이었고, 합성 조건에서 변화시켜준 chlorin e6의 양에 비례하여 Rluc8과 결합된 것을 확인하였다.
합성된 물질에 생체발광 기질인 coelenterazine을 넣어 실제 BRET이 일어나는지 확인해 본 결과, 생체 발광만 있을 때의 스펙트럼에 비해 chlorin e6이 결합된 Rluc8의 발광에서는 480 nm의 빛이 감소하고, 665nm의 빛이 증가함을 확인할 수 있었다. 480 nm의 빛이 감소된 이유는 chlorin e6에 의해 광자가 흡수 되었기 때문이고, 665 nm에서 형광이 발생한 이유는 생체발광에서 chlorin e6로 전이된 excited 광자가 chlorin e6에서 형광으로 바뀌었기 때문이다. 이러한 스펙트럼의 변화로 인해 BRET이 발생하였음을 증명할 수 있었다.
다음으로, 합성된 물질에서 BRET을 통해 활성산소가 발생되는지 SOSG의 형광변화를 통해 측정하였다. 4가지 합성 물질의 활성산소를 측정한 결과, chlorin e6가 결합된 양에 비례하여 활성산소의 발생량이 증가함을 알 수 있었다.
이 연구결과는 외부광원을 사용하지 않고 활성산소를 발생할 수 있는 물질을 이용해 빛이 닿지 않는 깊은 곳의 암을 치료할 수 있는 가능성을 보여주었다.
