Confocal fluorescence microscopy has been widely developed in order to observe biological samples. Because confocal fluorescence microscopy has capability of optical sectioning, high resolution and three-dimensional image of living tissue can be obtained. in vivo imaging shows a variety of biological phenome-na. When confocal microscopy collects a volume image, the laser focus must be scanned both laterally and axially. Advantageous of short measurement times and small system size are achieved, as we obtain depth information in situ. For this reason, confocal fluorescence microscopy that rapidly visualizes the three-dimensional distribution of fluorescent emitter can be useful tool in life science.
In this thesis, a new method for three-dimensional fluorescence imaging without depth scanning that we refer to as the dual detection confocal fluorescence microscopy (DDCFM) is proposed. DDCFM utilizes two photo multiplier tubes (PMTs) in the confocal detection system. The emitted fluorescence is divided by the beam splitter and received by the two PMTs through pinholes with different size. Each PMT signal gen-erates different axial response curve which shows relation depth, distance from focal point, and intensity. Also, the pinhole diameter decides stiffness of the curve. Since the PMT signal is determined by the intensity of the fluorescent emitter and the distance from the focal point, we can acquire depth position of a fluorescent emitter by ratio of two intensity signals from the PMTs. Comparing to the conventional confocal microscopy, DDCFM has many advantages. The measurement time is dramatically reduced for volume imaging. Also, photo-bleaching and photo-toxicity can be minimized. The system can be easily miniaturized because no mechanical depth scan is needed.
DDCFM is composed of 30-μm and 150-μm-diameter pinholes. In addition, 0.045-NA objective lens is used for 180μm-depth range. Fluorescent specimen for evaluation DDCFM system is made of 6 μm beads. Height change of beads is measured with DDCFM. DDCFM measure height of beads from intensity ratio and reconstruct 3-D bead image. Also, dual detection is compared with single detection.
형광 공초점 현미경은 광학적 절편이 가능하고 분해능이 높기 때문에 살아있는 생체 시편의 3차원 이미징이 가능하다는 장점이 있다. 이러한 공초점 현미경은 생물 시편 관찰에 유리한 여러 장점을 가지고 있으므로 널리 이용되며 관련된 연구가 이루어지고 있다. 살아 있는 생체 시편을 관찰은 분자들 간의 상호작용 및 동적인 일련의 과정을 알 수 있게 한다. 공초점 현미경으로 3차원 이미징을 하기 위해서는 시편 상의 초점이 횡방향과 축방향으로 이동 되어야 한다. 이때 초점의 축방향 이동 없이 시편의 축방향 이미징이 가능하다면 시스템의 소형화가 가능하며 측정 속도가 단축되는 이점이 있다. 따라서 축방향 위치 측정이 가능한 형광 공초점 현미경은 생물학과 의학 분야 등에서 유용한 측정 장비로 사용될 것으로 예상된다.
본 논문에서는 초점의 축방향 이동 없이 3차원 형광 이미징이 가능한 새로운 방법을 제안하며 이중 검출 형광 공초점 현미경이라고 명명한다. 이중 검출 형광 공초점 현미경은 기존의 공초점 현미경과 다르게 두 개의 광검출기를 사용한다. 시편에서 방출된 형광 신호는 광분리기에 의해서 두 경로로 나뉘고 각 신호는 크기가 다른 두 개의 핀홀을 통과하여 측정된다. 공초점 현미경으로 구해지는 축방향 응답 곡선은 빛의 세기와 초점 평면으로부터 떨어진 거리 간의 관계를 나타낸다. 이때 크기가 다른 두 개의 핀홀을 통과하여 구해진 축방향 응답 곡선은 반치폭이 다르다는 특징이 있다. 따라서 두 개의 광검출기로 측정된 각각의 형광 신호를 나눈 비로 형광 물질의 축방향 위치를 측정할 수 있다. 기존의 공초점 현미경과 비교하여 이중 검출 형광 공초점 현미경은 측정 속도가 빠르다는 장점이 있다. 이러한 장점으로 포토 블리칭(photo bleaching)으로 나타나는 문제를 줄일 수 있다. 또한 축방향 이미징을 위한 기계적 이송이 없기 때문에 시스템의 소형화가 가능하다.
제작된 이중 검출 형광 공초점 현미경은 지름이 30-μm와 150-μm인 핀홀을 사용하였다. 또한 NA가 0.045인 대물렌즈를 사용하여 측정 가능한 깊이가 180μm 이다. 이중 검출 형광 공초점 현미경의 성능을 평가하기 위해서 6 μm 형광 비드를 사용하여 시편을 제작하였다. 제작된 시스템으로 높이 변화 측정, 축방향 위치 측정, 다양한 빛의 세기에 대한 높이 측정, 3차원 영상 복원 실험을 수행하였다.
