This dissertation deals with the chemical/topographical modifications of neuron/material interfaces (NMI) and their effects on neuronal behaviors. Hippocampal neurons were cultured on various surfaces for the generation in vitro neural networks, and the morphological and functional properties of them were analyzed by light microscopy and microelectrode arrays (MEAs), respectively. Chemically functionalized NMIs included surface-initiated polymer films and self-assembled bio-inspired polymer films, and anodized aluminum oxide (AAO) nanostructures and assembled silica nanobead (SB) monolayers were fabricated for providing nanotopo-graphical environments to neurons. Observed neuronal responses to these NMIs included the formation of pat-terned neuronal networks, favored attachment and functional connections, and accelerated neurite devel-opment.
The patterned neural network was generated by surface-initiated, atom transfer radical polymerization of oligo(ethylene glycol) methacrylate (OEGMA), leading to the formation of pOEGMA films. The pOEGMA films exhibited highly cell-repellent characteristics due to the densely-packed poly(ethylene glycol) structures, and therefore they were expected to be an appropriate platform for patterned neural network with long-term stability. Surface-initiated polymerization of the pOEGMA films, activation of the terminal hydroxyl groups, microcontact printing of cell-adhesive molecules, and passivation of the off-pattern region were sequentially implemented, and the robust neuronal patterns were obtained. The functional interconnections between the neurons in the patterned networks were confirmed by patch clamping. As a biofunctionalization of electrode-based NMIs, polydopamine (PolyDA) films were introduced. PolyDA films have been reported to be a substrate-independent coating method, and capable of further modifications with many biomolecules, which were advan-tageous for multimaterial-based and multifunctional neural electrode devices. Biocompatibility of functionalized PolyDA films was confirmed on MEAs, and the films barely impeded the electrical recording or stimulation of microelectrodes. In addition, electrochemical deposition of PolyDA films was suggested as electrode-selective functionalization method, which enabled the fabrication of highly sophisticated multifunctional electrode arrays.
In order to provide nanotopographical environments to neurons, AAO substrates and SB-assembled sub-strates were fabricated by synthetic methods. These methods were selected because they are straightforward and reproducible, and the feature size of nanostructures can be controlled by varying synthetic conditions. The four different AAO substrates were named flat, small concave (pitch: smaller than 60 nm), large concave (pitch: 400 nm), and nanoporous (pitch: 400 nm). In case of SB-assembled substrates, the diameters of the beads were controlled to be 110, 190, 320, 480, or 670 nm by changing the re-growth cycles of seeds and the concentrations of reactants. On the AAO substrates, we have observed a pitch-dependent acceleration of neurite development at 1 day in vitro (DIV) distinguishing 60 nm (small concave) and 400 nm (large concave and nanoporous)-pitched substrates. Using SB substrates, we have observed that the acceleration of neurite development occurred on SBs only with bigger than 200 nm-beads, whose size was comparable with the thickness of filopodia at the tip of the growth cones. However, biochemical inhibition of fiopodial activity (1 μM of cytochalasin D) completely abolished the acceleration, and neurons on all of the SB-assembled substrates showed the same morphology. The results from two kinds of substrates indicate neurons respond to the nanostructures bigger than 200 nm, and this recognition is implemented by filopodial activities.
This dissertation is expected to contribute in vitro neuronal researches by suggesting NMIs as a versatile and reliable platform to manipulate or investigate neuronal behaviors.
본 논문의 주제는 신경세포/인공물질 계면(NMI)의 키모토포그래피적 개질법과 그에 따른 신경세포의 거동 변화에 대한 연구다. 해마 신경세포들이 여러 종류의 표면 위에 배양되어 생체 외 신경망을 형성하였고, 이들의 외형적, 기능적 성질들을 분석하기 위해 광학 현미경, 미세전극 어레이가 각각 사용되었다. 본 논문에서 소개된 화학적 기능화 방법의 예로는, 표면-개시중합된 고분자 박막과 자기조립 생체모방 고분자 박막이 있었으며, 양극산화된 산화알루미늄 나노구조(AAO)와 표면상에 조립된 실리카 나노비드(SB) 단층이 신경세포들에게 나노토포그래피 환경을 제공하기 위해 사용되었다. 이들 위에서 배양된 신경세포들에서 패턴된 신경망의 형성, 향상된 흡착 및 기능적 연결, 그리고 가속화된 신경돌기 발달이 관찰되었다.
신경세포 패터닝은 oligo(ethylene glycol) methacrylate (OEGMA)의 표면개시, 원자전이라디컬 중합법을 통한 pOEGMA고분자 박막을 이용해서 만들어졌다. 선행 연구들에서, pOEGMA 박막은 조밀하게 배열된 poly(ethylene glycol) 구조에서 기인한 높은 세포흡착방지성을 보였기 때문에, 장시간동안 안정한 신경망 패턴을 위한 플랫폼 물질로써 적절하다. pOEGMA 박막의 표면개시중합, 말단 수산화기의 활성화, 세포흡착성 물질의 미세접촉 프린팅, 그리고 세포 비흡착 지역의 표면 안정화 작업이 순차적으로 이루어졌고, 견고한 신경세포 패턴이 얻어졌다. 패턴된 신경망 내에서 신경세포간의 기능적 연결성 또한 패치 클램프를 통해 확인되었다. 한편, 전극 기반 NMI의 생기능화를 위한 폴리도파민 박막의 활용이 소개되었다. 폴리도파민 박막은 선행연구들에 의해, 표면 물질에 관계없고, 다양한 생분자들로 추후기능화 가능한 표면 개질 방법임이 밝혀졌는데, 이는 다양한 물질이 사용되고, 다양한 기능이 요구되는 신경 전극 디바이스의 표면 개질에서 매우 요구되는 성질이다. 본 논문에서는, 이러한 폴리도파민 박막을 MEA 표면 개질에 활용하여 이들이 MEA의 미세전극들을 이용한 전기신호 측정 및 전기자극 인가 기능들을 방해하지 않으면서도 신경세포들에 대한 적합성을 나타낸다는 사실을 밝혔다. 여기에 추가적으로, 기존의 방법과 다른 전기화학적 폴리도파민 박막 적층법을 개발하여, 이를 높은 복잡성을 가지는 다기능성 전극 어레이를 위한 전극 선택적 표면 개질 방법으로 제안하였다.
신경세포들에게 나노토포그래피 환경을 만들어주기 위해서, AAO 기판과 SB가 배열된 기판들이 합성을 통해 만들어졌다. 이 기판들이 선택된 이유는, 확실하고 재현가능한 토포그래피를 얻을 수 있고, 나노구조물들의 크기가 합성 조건의 변화를 통해 조절될 수 있기 때문이었다. 4개의 서로다른 AAO 기판들은 각각 60 nm 이하의 간격을 가지는 flat, small concave 기판과 400 nm의 간격을 가지는 large concave, nanoporous 기판으로 명명되었다. SB 기판들의 경우는, 반응물의 농도와 재성장 반응의 횟수를 통해 비드들의 지름이 110, 190, 320, 480, 670 nm 가 되도록 조절되었다. AAO 기판 위에서 1일 가량 배양된 신경세포들에게서, 60 nm와 400 nm 기판들을 구분짓는 피치-의존적 신경돌기발달 가속화 현상이 관찰되었다. SB 기판들 위에서 역시, 지름이 200 nm를 넘는 비드들 위에서만 같은 가속화 현상이 관찰되었는데, 이는 신경돌기 말단 growth cone의 filopodia의 두께와 비슷한 크기였다. 이를 확인하기 위해 filopodial activity를 억제할 수 있는 cytochalasin D를 처리한 결과, 모든 크기의 비드 기판 위에서 발달 가속화 현상이 완전히 사라졌다. 두 가지 기판 위에서의 결과들을 통해서, 200 nm 이상의 나노구조물 위에서 신경돌기발달 가속화 현상이 일어나며, 이는 filopodial activity에서 기인한다는 사실을 알 수 있었다.
본 논문은 신경세포 거동 연구를 위한 다재다능하고 믿을 수 있는 플랫폼으로써 NMI를 제안함으로써 생체 외 신경세포 연구에 크게 기여할 수 있을것으로 기대된다
