Studying protein conformational changes in native aqueous environment is a challenging task. For example, despite extensive studies, the solution-phase structures of the intermediates along the allosteric pathways for the transitions between the relaxed (R) and tense (T) forms have been elusive. In this work, we employed combined spectroscopy technique to reveal the conformational dynamics of homodimeric hemoglobin (HbI) from the clam Scapharca inaequivalvis. However, the time-resolved spectroscopy techniques do not provide the structural information of partially and fully photolysed HbI that are required to understand the allostry of heme proteins. To gain more knowledge about allostery of heme protein, we employed picosecond X-ray solution scattering and novel structural analysis to track the details of the structural dynamics of wild-type HbI and its F97Y mutant over a wide time range from 100 ps to 56.2 ms. From kinetic analysis of the measured time-resolved X-ray solution scattering data, we identified three structurally distinct intermediates (I(1), I(2), and I(3)) and their kinetic pathways common for both the wild type and the mutant. The data revealed that the singly liganded and unliganded forms of each intermediate share the same structure, providing direct evidence that the ligand photolysis of only a single subunit induces the same structural change as the complete photolysis of both subunits does. In addition, by applying novel structural analysis to the scattering data, we elucidated the detailed structural changes in the protein, including changes in the heme-heme distance, the quaternary rotation angle of subunits, and interfacial water gain/loss.The earliest, R-like I(1) intermediate is generated within 100 ps and transforms to the R-like I(2) intermediate with a time constant of 3.2 ± 0.2 ns. Subsequently, the late, T-like I(3) intermediate is formed via subunit rotation, a decrease in the heme-heme distance, and substantial gain of interfacial water and exhibits ligation-dependent formation kinetics with time constants of 730 ± 120 ns for the fully photolyzed form and 5.6 ± 0.8 μs for the partially photolyzed form.For the mutant, the overall kinetics are accelerated, and the formation of the T-like I(3) intermediate involves interfacial water loss (instead of water entry) and lacks the contraction of the heme-heme distance, thus underscoring the dramatic effect of the F97Y mutation. The ability to keep track of the detailed movements of the protein in aqueous solution in real time provides new insights into the protein structural dynamics.We tried to extend application of our approach combining the time-resolved X-ray solution scattering and the structural analysis to other protein systems that are showing large conformational changes. We applied solution scattering approach to track the light induced disassembly of decamer complex in the BLUF photoreceptor Synechocystis PixD. We successfully elucidated the signaling state formation in the PixD photoreceptor by our approach. The solution scattering technique has an ability to track the protein large conformational changes such as oligomer state assembly and disassembly that are not readily probed by X-ray crystallography technique.
생체 조건과 같은 용액상에서 단백질의 구조적 변화에 관한 상세한 정보를 얻는 것은 지금껏 많이 연구되지 않은 과제 중 하나이다. 예를 들어, 여러 가지 분석법을 사용한 많은 연구에도 불구하고 R-상태와 T-상태 사이의 다른자리입체성 (allosteric) 구조 변화 경로상의 중간체들에 대한 용액상 구조를 밝혀내지는 못했다. 본 연구에서는 시간 분해 분광학적 방법(time-resolved spectroscopy)을 적용하여 동종이합체 헤모글로빈(homodimeric hemoglobin, HbI)의 다른자리입체성 효과에 대한 구조적 변화를 연구하였다. 그러나 시간 분해 분광학 방법은 헴(heme) 단백질의 다른자리입체성 효과를 완벽하게 기술하기 위한 구조적 정보를 제공해주지는 못한다. 이를 보완하기 위해 피코초 x-선 액상 산란법(picosecond x-ray solution scattering)과 새로운 구조 분석법을 이용하여 와일드 타입(wild-type) HbI 및 F97Y 변종(mutant) 단백질에 대해 반응 시작 후 100 피코초(ps)에서 56.2 밀리초(ms) 시간대에 이르기까지의 반응 중간체에 대한 상세한 구조를 얻었다. 시간 분해 X-선 액상 산란 실험을 통해 얻어진 데이터를 이용한 반응 동역학 분석으로부터 구조가 다른 세 종류의 반응 중간체를 얻었고 (I(1), I(2), and I(3)) 와일드 타입과 변종 단백질에 대해 모두 같은 반응 경로를 가짐을 밝혔다. 리간드가 없는 형태와 하나의 리간드가 결합된 중간체는 같은 구조를 가졌으며, 이로부터 하나의 단위체(subunit)로부터의 리간드 광분해(photolysis)는 두 단위체로부터의 완전한 광분해와 같은 구조적 변화를 유발함을 알 수 있었다. 또한 새로운 구조 분석 방법을 산란 실험 데이터에 적용하여 단백질 내 헴간 거리, 단위체의 회전 각도, 그리고 계면의 물 분자 획득 및 손실에 관한 상세한 구조적 변화를 도출하였다. R-상태와 유사한 중간체인 I(1)은 100 피코초 이내에 형성되었고, 3.2 ± 0.2 나노초 후에 또 다른 R-상태 유사 중간체인 I(2)로 전환되었다. 이어서 T-상태 유사 중간체 I(3)가 단위체 회전을 통해 형성되었고, 헴-헴 거리는 감소하였으며, 물 분자가 들어오는 동역학적 전이를 보였다. F97Y 변종의 경우 전체적인 반응 속도가 증가하였고 T-상태와 유사한 I(3) 중간체로의 전이에서 물분자가 빠져나가며 헴-헴 거리 감소는 나타나지 않았다. 용액상에서 빠른 시간대에 대한 단백질의 자세한 구조 변화를 추적하는 이러한 방법은 단백질의 구조동역학 연구에 새로운 방향을 제시한다.
시간 분해 x-선 액상 산란과 이로부터 얻어진 데이터를 이용한 구조 분석을 다른 단백질의 경우에도 적용해보는 연구를 수행하였다. 액상 산란을 10합체(decamer) 구조인 BLUF 광수용체 Synechocystis PixD에 적용하여 빛을 받았을 때 이 10합체 구조가 분해되는 과정을 추적하였다. 본 연구를 통해 PixD 광수용체의 signaling state 형성에 대한 과정을 성공적으로 밝혀낼 수 있었다. 액상 산란을 이용하면 x-선 결정구조학에서 얻을 수 없었던 올리고머 상태(oligomer state)의 결합 및 분해와 같은 단백질의 구조적 변화를 규명할 수 있다.
