Hepatitis C virus (HCV) is a positive-sense, single-stranded RNA virus that is characterized by hepatotropism. A diverse range of cytokines are produced in response to HCV infection, and they induce amplification or transition of further immune responses. Virus-specific cytotoxic T cell responses are vital for the successful clearance of HCV infection. Major histocompatibility complex (MHC) class I is a key molecule for the recognition of virus-infected cells by cytotoxic T cells, and its expression is increased by type I or type II interferons (IFNs). In order to escape the virus-specific cytotoxic T cell responses, viruses have developed specialized mechanisms that subvert the antigen processing and presentation machinery. Yet, the effect of HCV infection on the expression of MHC class I is not well understood.
Recently, an in vitro cell culture system for HCV (HCVcc) infection has been developed using the HCV genotype 2a JFH-1 strain. This system mimics the complete viral life cycle, thus providing an opportunity to address many aspects of the HCV life cycle and host-virus interactions, including its effect on MHC class I expression, in a more physiological condition.
The production and infection of HCVcc in vitro each require quantification of infectious HCV virions. For this purpose, a focus-forming assay of HCV virions is typically performed by immunostaining HCV antigens with fluorochrome-conjugated specific antibodies and subsequent fluorescence microscopical observation. However, manual counting of foci by fluorescence microscopical observation is inconvenient and labor-consuming, and can yield biased results.
In the first part of the study, therefore, we established in vitro HCVcc system and developed and optimized a method of colorimetric focus-forming assay and image analysis, using an ELISpot reader for convenient and objective quantification of HCV virions.
In the second part of the study, we addressed whether HCV infection alters the expression of MHC class I in response to IFN using the in vitro HCVcc infection system. While the baseline level of MHC class I expression was not changed by HCV infection, type I IFN-induced MHC class I expression was notably attenuated in HCV-infected cells. Interestingly, forced expression of each HCV protein did not abrogate the IFN-effect on MHC class I expression. Instead, the replication of HCV RNA was required for the attenuation of IFN-induced MHC class I expression. Moreover, in contrast to the decrease in protein expression levels, IFN-induced MHC class I mRNA expression was not suppressed by HCV infection, implying that HCV regulates MHC class I expression at the level of translation, rather than of IFN signaling or transcription. The attenuated expression of IFN-induced MHC class I was associated with endoplasmic reticulum (ER) stress and activation of protein kinase R (PKR), and resultant suppression of protein synthesis in HCV-infected cells. Despite the presence of ER stress, IFN-induced MHC class I expression was not recovered by alleviation of ER stress in HCV-infected cells. On the contrary, HCV-associated PKR phosphorylation was reversed by silencing PKR expression in a dose-dependent manner. Hence, it is could be postulated that HCV-induced ER stress played little role, whereas replicating HCV RNA-induced phosphorylation of PKR was responsible for the attenuation of IFN-induced MHC class I expression.
In conclusion, we have established an in vitro HCVcc system and a novel method for quantification of HCV virions. From the second part of the study, we provide an insight into a possible mechanism in which HCV evades adaptive immune responses by exploiting PKR activation to attenuate IFN-induced MHC class I expression.
C형 간염 바이러스(hepatitis C virus; HCV)는 단일양성가닥의 RNA 바이러스로서 간세포 친화적(hepatotropism)인 특징을 가지고 있다. HCV에 감염되면 다양한 종류의 싸이토카인(cytokine)이 생성되는데, 이는 면역반응을 증폭시키거나 선천면역반응에서 획득면역반응으로의 이행을 도모하기도 한다. 바이러스-특이 세포독성 T세포(virus-specific cytotoxic T cell) 면역반응은 HCV감염을 제거하는데 있어 필수적이다. 한편, virus-specific cytotoxic T cell이 바이러스에 감염된 세포를 인지하기 위해서는 제1형 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex class I; MHC class I)가 필요한데, MHC class I 발현은 인터페론(interferon; IFN)에 의해 항진된다. 바이러스가 세포독성 T세포 면역반응을 회피하기 위해서 다양한 회피기전을 이용하는데, 그 중 하나가 MHC class I 발현을 조절하는 것이다. 한편, HCV가 MHC class I발현을 조절하는지 여부는 아직 불명확한 상태이다.
최근, HCV세포배양(HCV cell culture; HCVcc) 시스템이 개발됨에 따라 바이러스에 대한 숙주 반응을 비롯하여 다양한 HCV연구가 가능하게 되었다.
실험실에서 생성된 HCVcc로 연구를 하기 위해서는 먼저 감염성 있는 바이러스 입자인 비리온(virion)을 정량화하는 것이 필요한데, 전통적으로 형광면역염색법을 이용한 병소형성검사법(focus-forming assay)가 사용되어 왔다. 이 방법은 형광현미경을 사용하여 실험자가 focus의 개수를 직접 세어야 하기에 효율성 및 정확성이 떨어진다는 문제점이 있다.
이에, 전반부에서는 HCVcc 시스템을 확립하고 생성된 HCV virion을 정량화하기 위한 <발색병소형성검사법 및 영상분석을 이용한 병소 개수 자동산출방법>을 개발 및 확립하고자 하였다.
후반부에서는 HCVcc시스템을 이용하여 과연 HCV가 인터페론에 의한 MHC class I 발현 증가를 조절하는지 확인하고자 하였다. HCV에 감염되었을 때 MHC class I발현 자체는 변함이 없었으나, 인터페론 자극에 의한 MHC class I 발현증가의 경우 HCV에 의해 그 반응이 약화 되었다. 흥미롭게도 이러한 현상은 각각의 HCV 단백 자체에 의해서는 나타나지 않았으며, 대신 HCV RNA의 복제에 의해 유도되는 것을 확인할 수 있었다. 한편 HCV에 감염되었을 때 인터페론에 의해 유도되는 MHC class I의 발현 증가가 억제된 것과는 반대로 mRNA는 감소하지 않은 것으로 보아, HCV가 인터페론 신호전달이나 전사(transcription) 과정이 아닌 번역(translation) 과정에 관여하는 것을 알 수 있었다. HCV에 감염된 세포의 경우 소포체 스트레스(ER stress) 및 PKR 활성화가 관찰되었으며 이에 의해 번역시작인자(translation initiation factor)인 eIF2α가 인산화되어 결국 단백질 전사(합성)가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, ER stress와 PKR 활성화 중 어느 것이 주요 역할을 하는지 확인하고자 HCV에 감염된 세포에 ER stress 완화제를 처리해본 결과 인터페론에 의한 MHC class I 발현이 회복되지 않고 지속적으로 억제되어 있는 한편, shRNA-encoding lentivirus를 이용하여 PKR을 silencing한 경우 인테페론에 의한 MHC class I 발현이 회복되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 HCV에 감염이 되면 인터페론에 의해 유도되는 MHC class I 발현이 약화되는데, ER stress 보다는 PKR 활성화가 주된 원인임을 밝혔다.
결론적으로, 이 연구를 통하여 우리는 HCVcc 시스템을 확립하고 HCV virion 정량화를 위한 <발색병소형성검사법 및 영상분석을 이용한 병소 개수 자동산출방법>을 개발 및 확립하였으며, 또한 HCV가 PKR을 활성화 시킴으로써 인터페론에 의해 유도되는 MHC class I 발현을 약화시키고, 이를 통해 세포독성T세포 면역반응을 회피할 수 있는 가능성을 제시하였다.
