Structural modification of small interfering ribonucleic acids for efficient gene delivery = 효율적인 유전자 전달을 위한 소간섭 리보핵산의 구조적 변형에 관한 연구
서명 / 저자 Structural modification of small interfering ribonucleic acids for efficient gene delivery = 효율적인 유전자 전달을 위한 소간섭 리보핵산의 구조적 변형에 관한 연구 / Cheol-Am Hong.
저자명 Hong, Cheol-Am ; 홍철암
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2013].
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DBS 13011

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Gene silencing by RNA interference (RNAi) was discovered in C. elegans in 1998 as a response to long double-stranded (ds) RNA. The RNAi effect has been successfully extended to plants, Drosophila, and fungi. However, the introduction of long dsRNA into mammalian cells activates antiviral defense responses and nonspecific gene silencing. In 2001, RNAi-mediated gene silencing in mammalian cells was first reported by short, synthetic dsRNA, known as small interfering RNA (siRNA), which opened the door to RNAi technology for gene therapy. The synthetic siRNA has 19 ~ 21 base pairs with a 2-nucleotide overhang at both 3`-ends. The ability to easily design and customize siRNA sequences for any genes has made it more attractive for siRNA therapeutics. An siRNA is incorporated and unwound in RNA-induced silencing complex (RISC), and retains one strand of the siRNA duplex in cells. The RISC encapsulating a single strand siRNA guides the endonucleolytic cleavage of complementary mRNA, resulting in sequence-specific gene silencing. To achieve siRNA therapy, it is essential to transport exogenous siRNA into the cytoplasm of target cells due to endogenous RNAi pathway. To this end, viral vectors have been used for siRNA delivery owing to their ability to efficiently attach and transport own genomic materials into cells. They have shown high transfection efficiency. However, their clinical application has been restricted by the potential risks such as mutagenicity, inflammatory, and immunogenicity. These in-creasing concerns have led to the development of synthetic non-viral vectors. A variety of synthetic vectors based on cationic polymers, peptides, and lipids have been studied to form cationic nanocomplexes with poly-anionic nucleic acids by electrostatic interactions, which can facilitate cellular uptake through endocytosis. In general, plasmid DNA can be effectively condensed into stable complexes with sizes of approximately 200 nm upon contact with cationic carriers. Unlike plasmid DNA, siRNA forms unstable micro-sized complexes due to its relatively low charge density and stiff structure. To make condensed nanocomplexes, the use of high molecular weight cationic carriers has been attempted; however, it can induce severe cytotoxicity. Therefore, it is urgently needed to effectively package siRNA/cationic carrier complexes for enhanced cellular uptake and gene silencing. In this thesis, engineered siRNA structures were demonstrated as a new platform of non-viral siRNA delivery. An siRNA was modified chemically and physically to prepare a variety of two- and three-dimensional siRNA structures with RNAi activity such as nicked siRNA dimers, siRNA multimers, siRNA hydrogels, and terminal-functional siRNA. They can be condensed into stable, compact nanocomplexes with cationic poly-mers due to increased spatial charge density, structural flexibility, and complexation forces compared to unmodified siRNA. The intact antisense siRNA dimers linked with disulfided bonds and two short-stranded sense siRNA segments were hybridized to form nicked siRNA dimers with internal nicks in sense strands. The internal nicks reduced a persistent length of siRNA dimer backbones, improving chain flexibility. They showed a higher binding affinity to cationic oligomers, linear polyethylenimine (LPEI), than that of naked siRNA dimers and monomers. In addition, the nicked siRNA dimers/LPEI complexes exhibited effective target-gene silencing in cells by antisense strands. Controlled and self-assembled branched siRNA nanostructures, siRNA dendrimers were prepared by mixing six single-stranded DNA-siRNA chimeras and siRNA monomers. Their size, structures, and morphologies were controlled by an annealing strategy based on building blocks. The mean hydrodynamic diameter of siRNA dendrimers was 35.7 ± 3.8 nm with a narrow size distribution. The siRNA dendrimers were complexed with biocompatible, biodegradable poly(β-amino acid)s to form nanocomplexes, resulting in enhanced cellular uptake and gene silencing. Biologically active siRNA-based microhydrogels were designed for the first time. A single-stranded sense and antisense siRNA were conjugated with crosslinkers with three-way junctions to prepare Y-shaped siRNA molecules as building blocks. The resultant antisense and sense Y-shaped siRNA were mixed to form porous siRNA microhydrogels having a diameter of approximately 2 μm via complementary base pairing. They were dramatically condensed into compact complexes with about 100 nm in diameter. These complexes showed enhanced cellular uptake and gene silencing. The condensed nanogels incorporating siRNA were generated by reductively cleavable crosslinking of dithiolated siRNA at both 3′-ends with thiol-grafted LPEI within individual electrostatic complexes having loose, unstable morphology. The resultant siRNA/LPEI nanogels had a hydrodynamic diameter of 215 ± 8 nm and a zeta potential of 34.9 ± 3.9 mV. They were readily disintegrated to release active siRNA monomers upon exposure to reductive conditions. The highly condensed, stable nanogels exhibited enhanced cellular and gene silencing activity.

1998년 예쁜꼬마선충 (C. elegance)에서 긴 이중가닥의 리보핵산 (Ribonucleic acids, RNA)의 세포내 도입으로 특정 유전자의 발현이 억제되는 생물학적 현상인 리보핵산 간섭 (RNA interference, RNAi)에 대한 연구를 시작으로, 2001년 인간세포에서도 화학적으로 합성된 짧은 이중가닥의 ‘소간섭 리보핵산’ (Small interfering RNA, siRNA)에 의해 동일 현상이 규명되었다. 세포내로 도입된 이중가닥의 소간섭 리보핵산은 리보핵산 유도침묵복합체 (RNA-induced silencing complexes, RISC)와 결합하여 단일가닥이 되며 이들과 상보적인 염기서열을 갖는 전령 리보핵산 (messenger RNA, mRNA)를 특이적으로 분해하여 그 유전자의 발현을 억제한다. 기존의 약물들은 질병의 결과인 증상 및 통증을 완화하는 치료임에 반해 소간섭 리보핵산은 질병을 유발하는 근본적인 유전자를 치료하는 신개념 치료법으로 세계 의약품 시장에서 큰 관심을 받고 있다. 소간섭 리보핵산을 이용한 치료제 개발을 위해서는 세포외부의 소간섭 리보핵산을 표적세포내로 전달하는 것이 필수적이다. 현재, 바이러스성 전달체와 비바이러스성 전달체를 이용한 세포내의 소간섭 리보핵산 전달에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 바이러스 전달체는 바이러스의 감염 및 세포내 이동기전을 이용하여 소간섭 리보핵산의 높은 전달 효율성을 보였지만, 바이러스에 대한 면역반응, 돌연변이, 감염성에 대한 잠재적 위험성으로 실제 임상적용에 한계를 보였다. 바이러스의 안전상에 대한 문제로 최근에 양이온성 고분자를 이용한 비바이러스성 전달체에 대한 관심이 고조되고 있다. 그러나, 소간섭 리보핵산의 낮은 음전하밀도와 구조적 강직성은 양이온성 고분자와 결합하여 세포내 도입이 용이한 나노크기의 조밀한 양이온 복합체 형성을 매우 어렵게한다. 이에 본 연구는 소간섭 리보핵산 구조를 화학적 및 물리적으로 변형하여 양이온성 고분자와 안정한 복합체를 형성하는 새로운 소간섭 리보핵산 구조체를 개발하여 암세포내의 표적유전자의 저해를 규명하였다. 높은 음전하밀도와 구조적 유연성을 갖는 선형구조의 새김눈 소간섭 리보핵산 이량체 (Nicked siRNA dimers), 그리고 입체구조의 소간섭 리보핵산 덴드리머 (siRNA dendrimers)와 소간섭 리보핵산 하이드로젤 (siRNA hydrogels)를 개발하였다. 이들은 양이온성 전달체와 높은 이온결합력으로 안정한 복합체를 형성하여 세포내의 소간섭 리보핵산을 효과적으로 전달하였다. 새김눈 소간섭 리보핵산 이량체는 이황화결합으로 연결된 안티센스 이량체에 두개의 짧은 센스가닥들이 상보적인 염기쌍 결합으로 센스가닥 중심에 새김눈을 갖는 구조이다. 도입된 새김눈은 소간섭 리보핵산 이량체의 지속성 길이 (Persistence length)를 줄여 향상된 구조적 유연성으로 양이온성 고분자인 선형 폴리에틸렌이민 (Linear polyethylenimine, LPEI)과 이온결합력을 향상시켰다. 소간섭 리보핵산 덴드리머는 서로 다른 염기서열을 갖는 6개의 디옥시리보핵산 (Deoxyribonucleic acids, DNA)-리보핵산 혼성가닥들 (DNA-siRNA chimeras)과 소간섭 리보핵산 단일가닥들이 상보적인 염기간의 수소결합으로 형성된 나뭇가지 모양의 구조이다. 이들은 생체분해성 양이온 고분자인 폴리베타아미노산 [Poly(β-amino acid)s, PBAEs]과 효과적으로 결합하여 암세포내로 전달을 향상시켰다. 소간섭 리보핵산 하이드로젤은 Y 형태의 가교제 (Crosslinkers)를 이용하여 세개의 단일가닥을 갖는 센스 소간섭 리보핵산 삼량체와 안티센스 소간섭 리보핵산 삼량체를 각각 합성하여 그들의 상보적인 염기간의 수소결합으로 수 마이크로미터 크기의 다공성 구조이다. 이들은 선형 폴리에틸렌이민과 강력한 이온결합으로 100 nm 이하로 응축되어 안정적이고 조밀한 복합체를 형성하여 암세포내의 표적유전자를 저해하였다. 소간섭 리보핵산을 화학적으로 변형시켜 양쪽 3말단에 티올기 (Thiol groups)가 결합된 소간섭 리보핵산과 티올기가 접목된 선형 폴리에틸렌이민을 이황화결합으로 가교시켜 낮은 조밀성을 갖는 이온복합체를 안정한 나노크기의 복합체를 형성하였다. 이들은 세포내의 환원적 환경에 쉽게 이황화결합이 분해되어 효과적으로 소간섭 리보핵산을 유리시켜 표적유전자를 저해하였다. 또한, 가교된 선형 폴리에틸렌이민 역시 단량체로 유리되어 세포내 독성을 줄였다. 결론적으로, 소간섭 리보핵산의 구조적 유연성, 음전하 밀도, 응집력은 양이온성 고분자를 이용한 세포내 소간섭 리보핵산 전달 시스템에 매우 중요한 역할을 하였다. 효율적인 유전자 전달을 위한 소간섭 리보핵산 구조변형에 관한 연구는 현재 집중되고 있는 소간섭 리보핵산 전달체 개발과 더불어 새로운 가능성을 제시하였다. 더욱이, 분자생물학, 구조생물학, 나노구조분석 및 제조기술의 발달로 보다 향상된 유전자 치료효과를 갖는 소간섭 리보핵산 구조체 개발로 임상적용에 가능한 질병치료제의 도구로써 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.


청구기호 {DBS 13011
형태사항 xi, 110 p. : 삽도 ; 30 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 홍철암
지도교수의 영문표기 : Yoon-Sung Nam
지도교수의 한글표기 : 남윤성
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 References : p. 97-103
주제 Small interfering RNA (siRNA)
RNA interference (RNAi)
Engineered siRNA structures
siRNA delivery
소간섭 리보핵산
리보핵산 간섭
소간섭 리보핵산 구조변형체
소간섭 리보핵산 전달
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