Human serum albumin (HSA) is the most abundant circulating protein in human blood. In myocardial ischemia, the albumin-cobalt binding (ACB) assay is the only clinical test approved by the U.S. Food and Drug Administration for myocardial ischemia. The ACB assay has been thought that the ischemia-driven modification of HAS is localized within the NH2-Asp-Ala-His-Lys sequence of HSA. The high negative predictive value of ischemia-modified albumin (IMA) might be useful as an “elimination” marker in the emergency department. Despite the widespread use of the ACB assay, no absolute cutoff value has been established for the diagnosis of myocardial ischemia, and some controversial results have been reported. Recently, several studies have revealed a weak binding affinity of the N-terminus for cobalt compared to other sites of HSA, strongly implying that the primary binding site for cobalt is not the N-terminal region of HSA. Thus, an explanation for the low specificity of IMA in the ACB assay requires a greater understanding of the details of cobalt binding to IMA, which remain unclear.
In the proposed study, we developed a standardized assay compared with commercially available laboratory results and a multiple-well plate-based ACB assay.
An immunoassay for N-terminus of IMA for diagnosis of acute coronary syndrome was done by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in patients admitted to the emergency department with acute chest pain. Compared with a conventional ACB assay, the ELISA for N-terminal-modified HSA differentiated less accurately acute coronary syndrome from non-ischemic chest pain. In acute chest pain patients, the N-terminal site of HSA has a negligible or limited role in cobalt binding in the ACB assay.
The inhibition of cobalt binding was studied with drugs which selectively bind to Cys34 of HAS. Among these drugs, captopril showed inhibited cobalt binding to HSA. Captopril neither directly bound CoCl2 nor increased free cobalt in the ACB assay of rHSA whose Cys34 was blocked. In human sera of chest pain and normal control groups, captopril did not show a significant increase in the values of ACB assays. In this study, we could not find direct evidence that the binding inhibition of Cys34 with drug affected the assays value and that Cys34 could be a major site of cobalt binding in the ACB assay.
We developed three polyclonal antibodies for possible models of IMA: (a) Antibody #1 for com-mercial recombinant HAS whose Cys34 was replaced with alanine; (b) Antibody #2 for recombinant peptide: YLQQXPFEDH (X: mixture of 18 amino acids except cysteine and alanine); and (c) Antibody #3 for recombinant peptide: YLQQAPFEDH (Cys34 of HSA replaced by alanine). In acute chest pain patients, the value of absorbance in the ELISA showed significant differences between antibodies #1 and #2. However, with both antibodies, the area under the curve in ROC was lower than the value of cardiac troponin and the ACB assay. This showed the possibility that Cys34 has a direct effect on the differentiation of acute chest pain patients. Also, further study with a more specific monoclonal antibody is warranted.
As the conclusion of our study, we suggest that a certain change in Cys34 of HSA could have a major effect on ACB assay difference in acute chest pain patients.
알부민은 사람의 혈액 내에 순환하는 단백질 중 가장 많은 부분을 차지하고 있다. 또한, 급성 관상동맥 증후군 환자의 진단에 있어 혈청에 코발트(Co2+)를 혼합한 뒤 유리된 코발트의 양을 DTT을 이용한 발색으로 평가하는 검사법인 Albumin Cobalt Binding (ACB) assay는 미국식약청으로부터 심장허혈의 진단법으로 유일하게 승인 받았다. ACB assay는 혈관 내 허혈성 환경변화에 따른 혈청알부민의 N-terminal 부분(NH2-Asp-Ala-His-Lys)에 손상이 발생한 것이 금속결합을 저해시키는 원인으로 믿어져 왔다. 임상적으로 ACB assay는 심근에 혈류가 감소한 것을 매우 민감도 높게 의심할 수 있고 낮을 경우에는 심근허혈이 아니라고 배제 진단할 수 있는 응급실에서도 유용한 검사법이지만, 간접적인 검사법으로 진단의 특이도가 낮고 진단의 결정값이 확립되지 못한 단점이 크게 부각되고 있다. 또한, 최근의 몇몇 연구에서 사람의 알부민 N-terminal 부분이 알부민의 다른 금속결합 부위와 비교하여 코발트에 대한 결합친화력이 오히려 낮다는 연구보고와 N-terminal 부위의 절단으로는 설명하기 어려운 허혈회복에 따른 신속한 코발트결합력의 회복 등이 ACB assay의 분자단위 기전에 대한 의문점으로 제기되고 있다.
이에 ACB assay의 최초 기전으로 생각되었던 사람알부민의 N-terminal 아미노산 부분에 대한 직접적인 면역검사를 환자의 혈청에 적용한다면, 최근에 제기되는 결합친화력에 대한 환자 간의 차이를 확인하고, 낮은 특이도에 대한 추가정보를 확인할 수 있을 것으로 기대하였다.
N-terminal 아미노산이 절단된 사람알부민의 변형된 N-terminal 부분에 대한 다클론성 항체에 대한 면역검사로서 시판되는 효소결합면역흡착측정법(enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 급성흉통으로 응급실에 내원한 환자들의 혈청을 이용하여 연구하였다. N-terminal 이 변형된 사람알부민에 대한 면역검사 농도는 심근허혈이 있고 없음을 구분하지 못했으나, 흉통의 지속시간에 따라 3시간 이내 내원한 심근허혈 환자군에서 높은 경향을 보였고, 3시간이 넘게 지속되는 흉통을 가진 환자에서는 심근허혈 환자군이 정상군에 비해낮았다. 이러한, 실험결과는 사람알부민의 N-terminal 부분의 변화가 심근허혈 환자에서 ACB assay의 결과값의 변화를 설명하지 못한다고 판단된다. 다만, 시간에 따라 변하는 소견은 ACB assay 검사의 낮은 특이도의 원인으로 의심해 볼 수 있으나 이를 확인하기 위해서는 추가연구가 필요할 것이다.
이어서 사람알부민의 금속결합 부위에 특이적으로 결합한다고 알려진 약제들을 이용하여 ACB assay에서 혼합되는 코발트의 알부민 결합을 억제하는지 알아보고자 하였다. 그 중 Captopril이 정상인의 혈청과 재조합사람알부빈(N-terminal과 Cys34 부분에 변형이 있는 rHSA)에 처리하였을 때, 정상인 혈청에서 코발트의 결합을 더 많이 억제하였고, captopril 전처리 농도를 높임에 따라 정상인과 심근허혈환자에서 ACB assay 검사를 시행했을 때 차이만큼의 ABSU 값의 변화를 보였다. 이는 사람알부민의 Cys34부분에 특이적으로 결합하는 Captorpil 이 심근허혈에서 나타나는 사람알부민의 코발트 결합친화력에 주는 영향의 정도가 크며, 심근허혈에서 나타나는 코발트 결합을 저해하는 정도를 반영하며 진단에 사용되는 ACB assay의 검사값이 사람알부민의 Cys34 의 변화에 주요한 영향을 받는 것으로 의심된다.
사람알부민의 Cys34 의 변형이 심근허혈 환자의 진단에 도움을 주는 지와 어떠한 변형이 발생하는지 추정해보고자, Cys34과 주변 아미노산에 대한 치환을 통한 다클론성 항체 들을 제작하여 흉통환자의 진단에 적용하였다. 다클론성 항체를 다음과 같이 3개를 제작하였다: (a) 재조합사람알부빈, (b) 사람알부민의 Cys 34을 중심으로 10 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에서 중앙 Cys34를 제외한 나머지 아미노산을 알라닌을 제외하고 무작위 치환, (c) 사람알부민의 Cys 34을 중심으로 10 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에서 Cys34를 알라닌으로 치환. (a)와 (b) 다클론성 항체를 이용한 직접 면역검사법이 의미있게 급성흉통환자들 중 급성관상동맥 증후군과 비허혈성 흉통환자를 구분하였다. 그러나, 진단의 정확도를 측정한 ROC 분석에서는 심근효소(cTnI)와 ACB assay 가 보다 정확하게 급성관상동맥 증후군 환자를 진단하였고, 흉통발생 6시간 이내 내원한 환자에서는 ACB assay 만이 효과적으로 두 환자군을 구분할 수 있었다. 결론적으로 다클론성 항체는 Cys34 의 변형이 급성흉통환자의 감별진단에 일부 역할을 한다는 것을 보여주었다. 보다 명확한 결론을 위해서는 단일클론성 항체를 포함한 추가 연구가 필요하다.
상기 연구들을 통해 사람알부민의 Cys34 및 주변에서 발생하는 변형이 ischemia modified albumin 의 기전에 일부일 수 있으며, 이러한 변화를 측정하는 것은 급성흉통환자를 감별진단하는데 도움이 될 수 있다는 것을 보여주었다.
