As the biopharmaceutical industry and market have grown rapidly, the quality of biopharmaceutical proteins have also become important than a few years ago. Because the biopharmaceutical proteins normally are injected to human directly, many people is interested about the safety, the immunogenicity and half-life, and the efficiency, bioactivity as ADCC or CDC. The CHO cell lines used dominantly now are the outstanding cell line as producing cell line, however the limitation of quality derived from the difference of species is hard to overcome. As this point, F2N78, the new human fusion cell line, is able to become the attractive alternative of CHO cell lines for next generation.
As a first step, The expression and selection system was developed for new host cell lines, F2N78. A stable mammalian cell line which expresses a heterologous gene of interest is usually established by introducing the heterologous gene in a various host cell line together with a selectable marker gene by transfection. To get high secreting production cell lines expression vector has usually a selection maker gene with lower level of production condition by manipulating the genes, thereby the surviving cells express higher level production of heterologous transgene by amplifying the whole expression vector in the integrated state. F2N78 is not a metabolic-deficient engineered cell line as DG44. So It is needed to develop new concept selection system able to F2N78 directly. Study for a selection marker without functional polyA tail, without poly A system, to see the impact of this element in generation of stable production cell line showed a significant benefit. The clones transfected ‘without poly A’ selection marker showed higher production of antibody that that of traditional selection system. In addition, this new selection system maintain the antibody production through entire culture scale up from 96 well-plate to shake flask, and was more stable than the traditional system that did not eliminate poly A tail. In result, I can assume that ‘without poly A’ is possible to apply to F2N78 at industry scale large culture.
As a second step, to verify its potential as a human host cell line, recombinant F2N78 cells that produce antibody against rabies virus (rF2N78) were cultivated at different culture pH (6.8, 7.0, 7.2, 7.4, and 7.6) and temperatures (33.0°C and 37.0°C). Regardless of the culture temperature, the highest specific growth rate was obtained at a pH of 7.0-7.4. Lowering the culture temperature from 37.0°C to 33.0°C suppressed cell growth while allowing maintenance of high cell viability for a longer period. However, it did not enhance antibody production because specific antibody productivity did not increase at 33.0°C. The highest maximum antibody concentration was obtained at 37.0°C and pH 6.8. The N-linked glycosylation of the antibody was affected by the culture pH rather than the temperature. Nevertheless, G1F was dominant and G2F occupied a larger portion than G0F in all culture conditions. Compared to the same antibody produced from recombinant CHO cells, the antibody produced from rF2N78 cells has more galactose capping and was more similar to human plasma IgG. Taken together, the results obtained here demonstrate the potential of F2N78 as an alternative human host cell line for therapeutic antibody production. The one result that is out of expectation is the appearance of aglycosylation. The aglycosylation was detected at the most of conditions.
As a third step, It was observed that the most representative characteristic of F2N78 is the glycosylation profile of the product. The previous study showed that a F2N78 clone showed different glycosylation profile to typical CHO cell line. To verify the difference of glycosylation between F2N78 and CHOK1, a number of recombinant F2N78 and CHOK1 clones producing antibody were cultivated in shaker flask. Subsequently, one of clone from F2N78 and CHOK1 was cultivated at 3-L bioreactor scale to confirm that the trends of glycosylation were maintained at large scale culture. In the case of F2N78, G1F was dominant and G2F occupied a larger portion than G0F in all culture conditions. When compared with the same antibody produced from recombinant CHOK1 cells, the antibody produced from rF2N78 cells has more galactose capping and more similar to human plasma IgG. In addition, the aglycosylation was detected at the both of cell lines, F2N78 and CHOK1. The aglycosylation was detected when glucose is exhausted totally. The result drawed following hypothesis that overall glycosylation patterns of the product from F2N78 is highly galactosylated form and totally different trend with that generated from CHOK1.
To reduce aglycosylated antibody detected at the third step, the control of aglycosylation using fed batch culture was performed. Generally algycosylated form was produced under the glucose deficiency, therefore following conditions were designed; two glucose control condition from high concentration to low concentration and amino acid feeding condition to confirm the effect of amino acid. As the results, aglycosylation was totally controlled by glucose feeding, but amino acid did not affect significantly to aglycosylation. In addition, the feeding strategy with amino acid glucose together showed high osmolality, therefore uncontrolled glycosylation patterns. In this study, it becomes clear that the glucose control and development of proper feeding strategy are necessary for optimal production condition of F2N78 production clones.
In conclusion, F2N78 showed the positive potential as the host cell line for the production of therapeutic antibodies. F2N78 have the distinguishing characteristics of glycosylation when compared to traditional CHO cell lines. In addition, the similar patterns of growth profile with CHO cell lines make it possible to apply the know-how of culture methods using CHO cell to F2N78. To maximize the advantage of F2N78, the further process optimization for F2N78 will be needed and then it will be attractive for many researchers who want the new attempt for improving quality of the diverse biopharmaceuticals.
바이오 제약 산업과 시장이 빠르게 성장하면서, 바이오 의약 단백질의 질이 몇 년 전부터 중요해지기 시작했다. 보통 바이오 의약 단백질은 사람의 몸으로 직접 주입되기 때문에 많은 사람들은 면역반응과 반감기와 같은 안정성, 그리고 ADCC와 CDC로 대표되는 효율성에 굉장히 많은 관심을 보인다. 현재 가장 널리 쓰이는CHO 세포주는 생산성이 매우 뛰어나지만 종적 특이성에서 비롯되는 질적인 한계를 갖고 있다. 이런 관점에서 새로운 인간 융합 세포주인 F2N78은 다음 세대의 매력적인 CHO 세포주에 대한 대안이 될 수 있다.
새로운 인간 세포주인 F2N78은 HEK293과 Namalwa 세포의 융합에서 유래한다. F2N78은 부유 배양환경에서 일년간 EBNA1의 안정적인 발현을 보였으며 Namalwa 세포에서 보이는 IgM의 발현이 관찰되지 않았다. 그리고 인간 세포의 특이적인 당쇄화 효소인 N-acetylglucosamine transferase III (GnTIII) 와 alpha(2,6) sialyltransferase가 유지되었다. 이런 안정적인 EBNA1 유전자의 발현과 IgM의 소멸은 oriP 발현 vector를 통한 효율적인 일시적 단백질 발현에 적합한 조건이다. 결론적으로 체세포 융합에서 선택된 F2N78은 융합 대상 세포에서 유래된 형질을 안정적으로 유지하고 있고 재조합 의약품의 일시적 그리고 안정적 발현에 적합한 세포주이다. 게다가 EBV 유전자가 염색체 내에 결합되어 있지만 바이러스 감염에 대해 안정적이다.
첫 번째 과정으로, 새로운 숙주 세포주인 F2N78을 위한 발현 그리고 선별 시스템을 개발하였다. 안정적인 외부 유전자 발현 포유 세포주는 흔히 선별 유전자와 함께 외부 유전자의 형질 도입을 통해 이루어진다. 높은 발현 세포주를 선별하기 위해 발현 벡터는 선별 인자 유전자를 갖고 있고, 낮은 수준의 발현 조건에서 생존하게 하여 발현 벡터를 증폭 시키고 유전자 내에 안정적으로 결합되게 만든다. F2N78은 DG44와 같은 대사 유전자의 손실 돌연변이 세포주가 아니다. 따라서 기존에 쓰이던 방식과는 다른 선별 시스템이 필요하다. 새로운 선별 시스템인 without poly A 시스템은 안정적 발현 세포주의 구축에 확실한 장점을 보였다. ‘without poly A’ 선별 인자가 도입된 클론들은 기존의 시스템을 도입한 경우보다 높은 생산성을 보였다. 게다가 이 새로운 시스템은 96 well-plate에서 shake flask로 배양 부피를 증가시킴에 따라 기존의 시스템보다 더 안정적인 생산성 유지가 보였다. 결과적으로 ‘without poly A’ 시스템은 F2N78에 적용되어 대용량의 부유 배양에 까지 적용 될 수 있다.
두 번째 과정으로, 인간 숙주 세포주로서 가능성을 검증하기 위해, 광견병 항체를 생산하는 재조합 F2N78을 다양한 pH와 온도에서 배양하였다. 배양 온도에 관계없이, 가장 높은 성장률은 pH 7.0-7.4에서 보였다. 37.0°C에서 33.0°C로 온도를 감소시켰을 경우 세포 성장률은 감소하지만 배양기간은 증가하였다. 하지만 저온배양 시 생산성이 증가하는 것은 찾아볼 수 없었다. 가장 높은 최대 항체 생산량은 37.0°C, pH 6.8에서 얻을 수 있었다. 항체의 N-linked glycosylation은 배양 온도보다 배양 pH에 더 많은 영향을 받았다. 그럼에도 불구하고, G1F는 가장 대표적인 당쇄화 구조였고 G2F가 G1F보다 높은 비율을 차지하고 있었다. CHO 세포에서 생산된 항체와 비교해서 rF2N78에서 생산된 항체는 높은 galactosylation capping을 보였고 인간 혈장 내의 IgG와 더 유사한 경향을 보였다. 다만 대부분의 배양 조건에서 당쇄화 과정이 이뤄지지 않은 aglycosylation이 공통적으로 나타났다. 이 결과들은 F2N78의 항체 생산용 세포주로서의 가능성을 보여주었다.
세 번째 과정으로서, F2N78의 가장 대표적인 특징인 glycosylation의 경향에 대해 관찰하였다. 이전의 연구들은 F2N78이 많이 알려진 대표적인 CHO 세포의 glycosylation과 다른 경향을 보인다고 보고 했다. 이 두 세포주 간의 차이를 검증하기 위해 다수의 F2N78과 CHOK1 클론들을 shaker flask에서 배양하였다. 그리고 다양한 클론 간의 차이가 대용량 배양에서도 유지되는지 확인하기 위해 그 중 한 클론씩을 무작위적으로 선택하여 3-L bioreactor에서 배양하였다. F2N78의 경우, G1F가 가장 큰 비중을 차지하고 있고 G2F가 G0F보다 더 큰 비중을 차지하고 있다. 그리고 앞의 연구 결과와 같은 aglycosylation이 F2N78과 CHOK1에서 모두 나타났고 이는 배양 후반으로 갈수록 더 축적되는 경향을 나타냈는데, 이는 포도당이 고갈된 후로부터 일어난다는 것을 확인 할 수 있었다. 결과적으로 F2N78은 CHOK1과 다른 높은 high galactosylation을 보이며 인간의 glycosylation 경향과 비슷한 항체를 생산하였다.
이 세 번째 연구에서 나타난 aglycosylation을 줄이기 위해, 유가식 배양을 이용한 aglycosylation의 조절에 대한 연구를 진행하였다. 대체적으로 aglycosylation이 일어난 형태의 항체는 포도당이 고갈된 경우에 나타난다. 따라서 이 실험에서 아래와 같은 다섯 개의 실험군을 만들어서 이를 규명하고 조절하였다: 포도당의 농도를 높게 혹은 낮게 유지한 두 조건, 아미노산만을 첨가한 조건, 아미노산과 포도당을 같이 첨가한 조건 그리고 아무것도 첨가하지 않은 대조군. 그 결과 aglycosylation은 포도당이 첨가될 경우 완벽하게 조절되었다. 하지만 아미노산은 aglycosylation에 큰 영향을 미치지 못했다. 그리고 첨가물 전략에 의해 발생되는 높은 암모니아 농도나 삼투압은 glycosylation의 경향성과 aglycosylation의 정도에 영향을 미쳤다. 이 연구를 통해 포도당 조절과 접합한 첨가물 전략 그리고 배양 환경의 항상성은 안정적인 glycosylation의 유지에 필수적인 요소임을 알 수 있었다.
결론적으로 F2N78은 치료용 항체 생산을 위한 숙주세포주로서 긍정적인 가능성을 보여주었다. F2N78은 기존의 CHO 세포주와는 구별되는 glycosylation 특성을 보여주었다. 게다가 CHO 세포주와 비슷한 경향의 성장 곡선과 대사 경향성은 CHO 세포주에서 쌓인 배양의 노하우를 F2N78에 적용할 수 있는 가능성을 시사했다. F2N78의 장점을 최대화하기 위해 F2N78을 위한 공정의 최적화는 반드시 필요하며 이는 치료용 항체의 질을 향상시키고자 하는 사람들 모두에게 굉장히 매력적인 분야가 될 것이다.
