Bacteriophage T7 terminator Tφ is a class I intrinsic terminator recognized by T7 RNA polymerase and defined by a hairpin structure followed by a stretch of five to eight uridines at the 3’ end of RNA transcript. Owing to their simplicity, T7 RNA polymerase and terminator Tφ have been used as models for extensive studies on mechanisms of transcription initiation, elongation and termination. However, studies on physiological roles of terminator Tφ, on the other hand, are somewhat neglected.
Here, I want to revisit this well-studied terminator to fill in the seemingly neglected information on its physiological functions during the course of T7 phage infection. In addition to that, a closer look at the critical functional parts of terminator Tφ itself will further expand our knowledge on the mechanism and regulation of this terminator that can be applicable to other intrinsic terminators.
The first part of this study focused on dissecting essential functional elements of terminator Tφ, encompassing hairpin stem, hairpin loop and U-stretch. Tφ’s hairpin stem was gradually deleted to examine termination efficiency of truncated variants. I discovered that only the bottom six base pairs of Tφ’s hairpin stem (here named Stem3) were essential for termination function of this terminator. Stem3, however, was the minimal functional hairpin stem for Tφ, as any further single-base pair deletion from this stem resulted in drastic reduction of termination efficiency. Exchanges of Tφ’s hairpin loop to shorter tri-loop and tetra-loop altered termination efficiency to a certain extent, though no significant increase was observed. Shortening the U-stretch following Tφ’s hairpin by even just one uridine residue lead to significant reduction of termination efficiency, suggesting the full-length U-stretch is required for Tφ functionality. Interestingly, double deletion of one base pair from hairpin stem and one uridine from U-stretch resulted in reduction of termination efficiency equal to the combinatory reduction caused by single deletion from hairpin stem and single deletion from U-stretch alone, implying these two elements contributed additively to transcription termination activity of terminator Tφ.
In the second part of this study, I looked at the physiological roles of terminator Tφ during phage infection to E. coli. I observed here for the first time that deletion of terminator Tφ from T7 genome (resulting in Tφ-lacking mutant) lead to both reduction in phage burst size and delay in phage lysis time. These two life traits are among the most important indexes of a bacteriophage, which together can strongly affect its success on adapting to changes in environment. Deletion of terminator Tφ caused unanimously increase in expression level of all terminator downstream genes in T7, including holin - a transmembrane protein that created lesion in E. coli host membrane during infection. Holin induced membrane lesions allowed for the release of lysozyme to degrade host cell wall, thus effectively killed host cell and released phage progenies at the end of an infection cycle. Holin upregulation was the cause of reduction in phage burst size in Tφ-lacking mutant during infection since similar burst size reduction was observed when wild-type T7 infected to E. coli host overexpressing holin alone. However this overexpression of holin also lead to hastened lysis time of wild-type T7, suggesting the delayed lysis time of Tφ-lacking mutant was caused by some yet unknown factors. Remarkably, when Tφ-lacking mutant was allowed to evolve, it recovered both wild-type burst size and lysis time through additional deletion of a genomic region coding for T7 genes 0.5, 0.6 and 0.7. The mechanism of how this additional deletion countered the effect of Tφ deletion was suggested in this study.
파아지 T7 종결자 Tφ 는 class 1 에 해당하는 고유의 종결자로서 T7 RNA 중합효소가 인지 하고 머리핀 구조와 3’ 말단 RNA 다섯개에서 여덟개의 uridine 을 가지고 있다. 특성상 T7 종결자의 단순한 기작 때문에 전사 시작, 전사 연장, 전사 종료기작을 연구할 때 많이 쓰인다. 하지만 Tφ의 직접적인 역할에 대한 연구가 미흡하고 정보가 부족하다. 그래서 나는 T7 파아지가 박테리아를 직접 감염시키는 상황에서 Tφ 종결자의 아직 밝혀지지 않은 역할을 연구하였다. 또한 이 연구를 통하여 class 1에 해당하는 고유 종결자의 기작과 조절의 이해를 돕고 Tφ 종결자의 중요한 기능을 들여다 볼 수 있다.
이 연구의 첫번째 부분의 중점은 Tφ 종결자의 핵심적인 역할을 담당하는 머리핀의 줄기, 고리, U 가 반복되는 부분을 잘라 각각의 기능에 대하여 연구하였다. Tφ 종결자의 머리핀 줄기 부분을 조금씩 잘라 보면서 잘려진 RNA와 전사종결의 효율을 측정하였다. 실험 결과 머리핀 아래 여섯 염기쌍 (Stem3) 부분이 종결자로서 핵심을 담당하는 것을 밝혔다. Stem 3 부분에서 한 개의 염기쌍이 없어질 경우 전사 종결 효율이 급격하게 떨어지는 것이 관찰되었다. Tφ 종결자를 짧게 tri-loop 과 tetra loop으로 바꿨을 때에는 전사 종결 효율이 약간 늘어나는 현상을 보였지만 통계적으로 의미 있는 값은 찾지 못하였다. 연속되어 있는 U 부분을 짧게 줄여 주었을 때 에도 하나의 uridine 이 없어질 경우 전사 종결효율이 급격하게 떨어졌다. 따라서 연속되어 있는 U 부분은 Tφ 종결자의 역할에 필요한 부분이라고 해석할 수 있다. 흥미롭게도 머리핀 부분에 있는 한 개의 염기쌍과 이와 함께 연속되어 있는 U 부분을 동시에 없앤 전사 효율을 측정한 결과 각각 머리핀 부분에 있는 한 개한 염기 쌍을 없앨 경우와 연속되어 있는 U 부분을 없앨 경우의 전사 효율의 종합적인 결과로 나타났다. 따라서 각각의 요소들은 Tφ종결자의 역할에 따로 작용하며 복합적으로 전사 종결 효율을 상쇠 할 수 있는 결론을 내렸다.
본 연구의 두 번째 부분은 E. coli 가 파아지에 감염됐을 때 종결자 Tφ 의 생리적 역할을 규명하는 것에 초점을 맞추었다. 여기서 최초로 종결자 Tφ 가 T7 게놈에서 제거되면 (그리하여 Tφ이 없는 돌연변이가 탄생했을 때) 파아지의 방출량이 줄어들고 용균 시간이 늘어난다는 것을 확인했다. 이 두 가지 특성은 파아지가 얼마나 주변 환경의 변화에 성공적으로 적응하느냐의 여부를 결정하는 중요한 지표다. 또한 종결자 Tφ 을 제거하자 T7에서 holin을 포함한 종결자 하류의 모든 유전자들의 발현이 증가하는 것을 확인하였다 (holin은 막관통단백질로써 파아지가 E. coli 숙주를 감염시킬 때 세포막에 균열을 만드는 역할을 한다). 감염 주기의 마지막 부분에서 Holin으로 인해 생긴 세포막의 균열에서 방출된 라이소자임은 숙주의 세포벽을 녹이고 효과적으로 숙주를 죽였으며 이로써 차대 파아지들이 방출되었다. Holin의 발현 증가가 바로 Tφ이 없는 돌연변이가 숙주를 감염시켰을 때 파아지 방출량이 줄어드는 원인이었다. 왜냐하면 비슷한 방출량의 감소가 야생형 T7이 holin만 과발현하는 E. coli 숙주를 감염시켰을 때 목격되었기 때문이다. 하지만 이런 holin의 과발현은 오히려 야생형 T7의 용균 시간을 줄여줬기 때문에 Tφ이 없는 돌연변이의 늘어난 용균 시간은 아직 알려지지 않은 다른 요소에 의한 것임을 암시한다. 흥미롭게도 Tφ이 없는 돌연변이가 진화하도록 하자 T7 게놈에서 0.5, 0.6, 0.7 유전자가 기록된 구간을 자름으로써 다시 야생형의 방출량과 용균 시간을 회복하는 것을 목격했다. 본 연구에서 T7이 어떻게 이렇게 추가적으로 유전자를 자름으로써 Tφ 제거로 인한 효과를 무효화 하는지도 암시하였다.
