MUS81 is a highly conserved endonuclease with homology to the XPF subunit of the XPF-ERCC1 complex and catalytically active in a complex with a single regulatory subunit in lower eukaryotes, Mms4 and Eme1 in budding and fission yeasts, respectively, and two regulatory subunits, EME1 and EME2 in humans. In this study, we found that MUS81-EME2 is distinct from yeast Mus81-Mms4 and human MUS81-EME1, although they all share substrate specificity in common, cleaving various DNA structures including 3’ flaps, replication forks, and nicked Holliday junctions. We found that MUS81-EME2 only was able to resolve efficiently intact Holliday junctions unlike recombinant Mus81-Mms4. Furthermore, it was able to cleave nicked and gapped duplex DNA, generating two fragments. Ligatable nicks were significantly more resistant than nonligatable ones to the cleavage by MUS81-EME2, indicating its role in repair of abnormal DNA. Our biochemical data provide evidence that MUS81-EME2 alone could resolve Holliday junctions in higher eukaryotes such as mammals. This activity is in strong contrast to the nick-dependent cleavage of Holliday junctions by Mus81-Mms4 or MUS81-EME1. Our result raises the possibility that MUS81-EME1 and MUS81-EME2 are functionally distinct, playing related but non-overlapping roles in DNA transactions.
인간MUS81 은 XPF family에 속하는 구조 특이적인 endonuclease 로써 Holliday junction (HJ) resolvase 역할을 수행할 것으로 추측된다. 모든 진핵세포의MUS81은 단백질의 안정성과 nuclease 활성을 유지하기 위해 파트너 단백질이 필요하다. 인간의 경우는 MUS81은 서열이 유사하지만 크기가 다른 EME1또는 EME2와 안정적인 복합체를 형성하여 생화학적 기능을 수행한다. 인간MUS81-EME1은 MUS81-EME2 에 비해서 연구가 활발하게 이루어져 왔다. MUS81-EME1은 replication fork 나 homologous recombination 과정에 생성되는 3’ flap 또는 RF 구조를 포함한 branched DNA와 nicked HJ 을 intact HJ보다 더 선호하여 효율적으로 자른다고 알려져 있다. 이러한 측면에서 볼 때, 인간 MUS81 complex는 재조합 발아효모 Mus81-Mms4 혹은 분열효모Mus81-Eme1 와 유사한 특성을 가진다고 볼 수 있다. 하지만 인간 MUS81-EME2 complex는 MUS81-EME1 complex와 비슷한 기질 특이성을 가질 것이라고 믿어져 왔기 때문에 지금까지 거의 연구되어지지 않았다.
앞서 발표된 논문에 의하면 N-terminal 부분 결손된 서브유닛으로 만든 MUS81256-551- EME1244-571 복합체는 wild type 복합체보다 intact HJ 구조를 보다 더 효율적으로 잘라 linear duplex로 전환시킬 수 있음이 알려졌다. 또한 HeLa 세포에서 면역침강법으로 얻은 MUS81 복합체는 in vitro에서 HJ를 효율적으로 자를 수 있음이 보고되었다. 하지만 본 실험실을 포함한 여러 실험실에서 대장균에서 정제한 재조합 인간MUS81-EME1은 in vitro에서 intact HJ 구조를 자르지 못함이 관찰되었다. 이 결과는 MUS81 복합체가 HJ 구조를 처리할 수 있다는 것을 시사하지만 확실한 결론을 도출하였다고 하기에는 미흡하다. MUS81-EME2 경우는 MUS81-EME1에 비해서 연구가 거의 이루지지 않았기 때문에, 이에 우리는 인간 MUS81-EME2가 RF regression으로 생길 수 있는 HJ 구조 또는 Okazaki fragment processing의 실패로 생길 수 있는 여러 구조를 자를 수 있는지의 여부를 밝히고자 했다.
이를 위하여 우리는 두 인간 MUS81 복합체를 동일한 방법으로 정제하여 각각의 단백질의 생화학적 활성을 여러 가지 구조를 갖는DNA 기질을 사용하여 비교해 보았다. 그 결과, MUS81-EME2가 MUS81-EME1에 비해서 실험에 사용한 모든 DNA 구조를 더 효율적으로 자르는 것을 확인하였다. MUS81-EME1와 MUS81-EME2는 모두 3’ flap 기질을 자르고 gapped linear duplex (gDS)를 생성하였다. 한가지 흥미로운 사실은, MUS81-EME2의 양을 늘릴 경우 또 다른 분해 산물이 추가로 생기는 것을 확인했다. 그리고 이 분해 산물은 첫 번째 생긴 분해산물인 gDS가 많이 축적되었을 경우 생기고, MUS81-EME2 양을 증가시킬수록 gDS의 양이 줄어들면서 두 번째 분해산물이 증가하는 것을 native gel electrophoresis를 통해서 확인할 수 있었다. 따라서 우리가 MUS81-EME2가 gDS 구조를 자르는 새로운 활성이 있다는 것을 발견하였다.
지금까지 인간 MUS81 complex의 HJ resolvase 활성에 대해서는 상반된 연구가 있고, 이를 확증할만한 결과가 아직 없었다. 이 논문에서 우리는 MUS81-EME2가 HJ resolvase 활성을 가지고 있는지 여부를 연구하기 위해서 synthetic HJ를 만들어서 MUS81-EME1과 MUS81-EME2에 대한 비교 실험을 수행하였다. 그 결과 in vitro에서 MUS81-EME2는 intact HJ 구조를 효율적으로 자르는 것을 관찰할 수 있는 반면, MUS81-EME1는 HJ를 그렇지 못함을 관찰 했다. MUS81-EME2 복합체에 의한 HJ 분해는 맞은 편 junction부위에 여러 번의 절단이 순차적으로 일어나는 방식으로 인하여, 후에 gapped duplex 나 짧은 5’ flap을 가진 분해산물이 만들어 지게 된다. MUS81-EME2 복합체의 이러한 작용 기작은 다른 인간 및 효모MUS81 복합체에서도 유사하다고 믿어진다 (Chen et. al., 2001; Constantinou et. al.,2002; Gaillard et al., 2003). 이러한 여러 실험을 통해 우리가 새롭게 발견한MUS81-EME2의 활성은 진핵세포에서 MUS81복합체의 역할을 이해하는데 있어서 매우 중요한 발견으로 생각된다.
지금까지 인간 MUS81 complex의 HJ resolvase 활성에 대해서는 상반된 연구가 있고, 이를 확증할만한 결과가 아직 없었다. 이 논문에서 우리는 MUS81-EME2가 HJ resolvase 활성을 가지고 있는지 여부를 연구하기 위해서 synthetic HJ를 만들어서 MUS81-EME1과 MUS81-EME2에 대한 비교 실험을 수행하였다. 그 결과 in vitro에서 MUS81-EME2는 intact HJ 구조를 효율적으로 자르는 것을 관찰할 수 있는 반면, MUS81-EME1는 HJ를 그렇지 못함을 관찰 했다. MUS81-EME2 복합체에 의한 HJ 분해는 맞은 편 junction부위에 여러 번의 절단이 순차적으로 일어나는 방식으로 인하여, 후에 gapped duplex 나 짧은 5’ flap을 가진 분해산물이 만들어 지게 된다. MUS81-EME2 복합체의 이러한 작용 기작은 다른 인간 및 효모MUS81 복합체에서도 유사하다고 믿어진다. 이러한 여러 실험을 통해 우리가 새롭게 발견한MUS81-EME2의 활성은 진핵세포에서 MUS81복합체의 역할을 이해하는데 있어서 매우 중요한 발견으로 생각된다.
