Beyond natural 20 amino acids, unnatural amino acids having novel functional group have been consolidated into the existing genetic code as a 21st genetic code. Applications of genetically encoded unnatural amino acids enable new means for tailored manipulation of proteins, such as site-specific labeling or modification of protein, probing protein structure and function, identifying and regulating protein activity, and generating proteins with new properties. In this study, we used genetic code expansion technique for effective surface-based protein analysis, especially single-molecule analysis.
Immobilization of proteins in a functionally active form and proper orientation is crucial for effective surface-based analysis of proteins. Here we present a general method for controlled and oriented immobilization of protein by site-specific incorporation of unnatural amino acid and click chemistry. The utility and potential of this method was demonstrated by applying it to the analysis of interaction between a pathogenic protein DrrA of Legionella pneumophila and its binding partner Rab1 of human. Kinetic analysis using Surface Plasmon Resonance revealed that immobilization of site-specifically biotinylated DrrA results in about 10-fold higher sensitivity in binding assay than the conventional immobilization of DrrA with random orientation. The present method is expected to find wide applications in the fields of the surface-based studies of protein-protein (or ligand) interactions, drug screening, biochip, and single molecule analysis.
For effective single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (smFRET) analysis of protein, site-specific dual-labeling with two fluorophores as an energy donor and an acceptor is crucial. Here we showed a case that site-specific labeling of protein via incorporation of unnatural amino acid gives rise to high distributional homogeneity in the FRET efficiency histogram compared to the conventional method using double cysteines, enabling a more effective smFRET analysis of protein. As a model study, maltose binding protein was dually labeled via incorporation of ρ-azido-L-phenylalanine and cysteine at specific positions, immobilized on a surface, and subjected to smFRET analysis under native and denaturing conditions. We show that the use of unnatural amino acid and click chemistry for site-specific labeling of protein provides a clearer picture of unfolding processes than using double cysteines. Furthermore, we have also developed a simple and more general approach to site-specific dual-labeling of proteins via incorporation of two unnatural amino acids. This strategy employs readily available unnatural amino acids, commercial dye conjugates, and the newly engineered aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA pairs. Our method enables highly selective bio-orthogonal conjugation of two fluorescence dyes, being devoid of problems and limitations of conventional cysteine-based labeling, thus it can be generally applied to various proteins for FRET analysis. Our labeling scheme can be extended to site-specific multiple labeling of proteins, which will be useful for investigating more complicated molecular dynamics.
지난 20여년간의 연구를 통해 자연계에 존재하는 일반적인 20개의 아미노산을 뛰어넘어, 새로운 기능기를 가진 비천연 아미노산 (unnatural amino acid)이 21번째 유전 암호로서 도입 되어 다양한 분야에서 활발히 활용되어 왔다. 유전자로부터 발현되는 비천연 아미노산을 활용하여 단백질을 목적에 맞게 변형할 수 있게 되었고, 이를 통해 단백질의 위치 특이적인 표지나 가공, 구조나 기능의 분석, 활성의 조절 등 단백질에 새로운 기능을 부여함으로써 그 특성을 분석하거나 새로운 생체 분자를 만드는 데 효과적으로 활용할 수 있게 되었다. 지금까지 발표된 연구 결과들을 응용하여, 본 연구에서는 유전 암호의 확장 기술 (genetic code expansion), 즉 비천연 아미노산을 효과적인 단분자 단백질 분석에 활용하여 지금까지 발표 된 방법들 보다 뛰어난 새로운 분석 방법을 개발하였다.
단백질을 분석하는데 있어서 특정 표면에 단백질을 고정 하는 것, 특히 단백질의 기능 및 활성을 유지하며 정해진 방향으로 고정하는 것은 매우 중요한 과정이다. 본 연구에서는 비천연 아미노산을 단백질의 특정 위치에 삽입함으로써 단백질을 일정한 방향으로 조절하여 표면에 고정할 수 있는 방법을 개발하였다. 상호 결합하는 단백질들에 이 방법을 적용하였고, 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance) 기술로 분석한 결과 기존의 표면 고정 방법에 비해 10배 이상 높은 민감도를 확인할 수 있었다. 이는 단백질들간의 상호작용 및 신약 개발, 단분자 분석 등 다양한 분야에 효과적으로 적용할 수 있을 것으로 기대 된다.
형광에너지 전이 현상(FRET)을 이용한 단분자 (single-molecule) 단백질 분석에서 2개의 형광 물질을 단백질의 특정 위치에 표지하는 것은 정확한 분석을 위해 가장 중요하며 필수적인 과정이다. 이를 효과적으로 수행하기 위해서 많은 연구가 이루어졌으나 아직까지 보편적으로 사용할 수 있는 방법의 개발은 많은 시도에 비해 그 결과가 충분하지 못하였다. 본 연구에서는 하나의 비천연 아미노산을 활용하여 단백질의 특정 위치에 형광 물질을 표지하는 방법이, 기존의 임의로 두 개의 형광 물질을 불특정 위치에 표지하는 방법에 비해 더욱 정확한 단분자 형광 에너지 전이 분석 (single-molecule FRET analysis) 결과를 얻을 수 있는 것을 확인하였다. 나아가 두 개의 비천연 아미노산을 단백질에 성공적으로 삽입하였고, 이를 통해 리간드 결합에 따른 단백질의 구조 변화를 단분자 형광 에너지 전이 분석으로 정확하게 관찰할 수 있다는 것을 입증하였다. 본 연구 결과를 통해 기존의 시스테인을 통한 단백질 표지 방법이 갖고 있던 실질적인 한계를 극복함으로써 단분자 분석의 적용 가능 분야를 획기적으로 확대하였고, 이를 활용하면 분자들 간의 상호결합 메커니즘이나 효소의 촉매 반응과 같은 중요한 생명 반응과 관계된 단백질의 움직임을 더 깊이 이해할 수 있을 것으로 기대 된다.
